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蛋白质的分泌机制原核细菌周质中含有多种分子伴侣可阻止分泌蛋白的随机折叠，分泌在细胞周质或培养基中的重组蛋白很少形成分子间的二硫键交联，因此与包涵体相比，分泌型重组蛋白具有较高比例的正确构象，生物活性的回收率增加，且对蛋白酶不敏感第190页,共232页，2024年2月25日，星期天重组大肠杆菌--目的蛋白完全分泌分泌型目的蛋白表达系统构建有些G-能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中,这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白,它激活定位于内膜上的磷酸酯酶,导致细菌内外膜的通透性增大。将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化受体细胞完全分泌型受体细胞转化bacteriocin第191页,共232页，2024年2月25日，星期天相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍。第192页,共232页，2024年2月25日，星期天在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。第193页,共232页，2024年2月25日，星期天影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素外源基因表达产量与细胞浓度和细胞表达产量呈正相关。单个细胞产量取决于：⑴外源基因的拷贝数增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目，增加表达效率。但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。第194页,共232页，2024年2月25日，星期天⑵外源基因的表达效率①启动子的强弱②转译起始序列对表达效率的影响③SD序列和起始密码ATG的间距④密码子组成⑤核糖体接合位点的有效性：消除核糖体及其附近的潜在二级结构第195页,共232页，2024年2月25日，星期天5’-TTGACA-3’5’-TATAAT-3’①-35box②-10box（PribnowBox）1.启动子的结构对表达效率的影响RNA聚合酶σ亚基的识别位点（1）一致顺序第196页,共232页，2024年2月25日，星期天（3）-35区与-10区之间的距离间隔为17bp时，启动子最强。（2）-35区和-10区的碱基顺序越接近一致顺序，启动子越强。5’-TTGACATATAAT一致顺序lactrp?PLrecAtacItacII5’-TTTACATATGTT5’-TTGACATTAACT5’-TTGACAGATACT5’-TTGATATATAAT5’-TTGACATATAAT5’-TTGACATTTAAT-35box-10box第197页,共232页，2024年2月25日，星期天RNA聚合酶同启动子结合的区域称为启动子区。将各种原核基因同RNA聚合酶全酶结合后，用DNase水解DNA，最后得到与RNA聚合酶结合而未被水解的DNA片段，这些片段有一个由5个核苷酸(TATAA)组成的共同序列，以其发现者的名字命名为Pribnow框(Pribnowbox)，这个框的中央位于起点上游10bp处，所以又称-10序列(-10sequence)，后来在-35bp处又找到另一个共同序列(TTGACA)。离开共同顺序较远的启动子的活性亦较弱第198页,共232页，2024年2月25日，星期天Hogness等在真核基因中又发现了类似Pribnow框的共同序列，即位于-25～-30bp处的TATAAAAG，也称TATA框(TATAbox)。TATA框上游的保守序列称为上游启动子元件(upstreampromoterelement，UPE)或上游激活序列(uptreamactivatingsequence，UAS)。另外在-70～-78bp处还有一段共同序列CCAAT，称为CAAT框(CAATbox)第199页,共232页，2024年2月25日，星期天基因转录起始位点上游序列的比较TTGACATATAATPuPy-35区-30-70正调控区-20负调控区+1-10区GC区….CAAT区TATAAATPuAPy-40-110+1-20-30