动物病毒类疾病的实验室诊断（动物微生物课件）.pptx

任务四：动物病毒病的实验室诊断;一、标本的采集与处理;一、标本的采集与处理;一、标本的采集与处理;细胞形态的改变;三、病毒的分离培养与初步鉴定;电子显微镜检查：

*透射电子显微镜

用于观察病毒的大小、形态与结构及细胞内的超微结构等

*扫描电子显微镜：

用于观察病毒和细菌表面结构和附属结构等

;H1N1流感病毒电子显微镜图片;原代细胞培养

二倍体细胞培养

传代细胞;1.组织细胞培养;12;选择不同的接种部位是病毒分离成功的关键

常用的主要有：

尿囊腔接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种;尿囊腔接种;卵

黄

囊;常用的实验动物有小白鼠、乳鼠、豚鼠、家兔、猴和鸡等

常用的接种途径包括皮下、皮内、腹腔、静脉、角膜、鼻腔及脑内接种等方式;正常细胞病变细胞;;三、病毒的分离培养与初步鉴定;四、动物接种试验;原理：用已知的病毒抗原检测患者血清中的抗体水平或

用已知的病毒抗体直接检测标本中的病毒抗原

;1.核酸分子杂交技术

2.聚合酶链反应（PCR）-----多种病毒的快速诊断

3.基因芯片技术----如检测H1N1甲型流感病毒

4.基因测序----如病毒耐药基因型的检测;鸡新城疫病毒引起的鸡新城疫(ND)是极易传染的毁灭性疾病，被国际动物卫生组织（OIE）列为A类传染病，最常侵袭家鸡和珍珠鸡，也能感染其他家禽和野鸟。;成熟的病毒粒子直径约为100～250nm，有囊膜的病毒粒子呈圆形，但常因囊膜损坏而形态不规则。囊膜上有纤突长约8nm，为脂蛋白，具有血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）活性。病毒粒子的内部有一核心，就是病毒的核衣壳，直径约17nm。;新城疫病毒（NDV）在55℃经45分钟或阳光直射下经30分钟灭活，但NDV对低温抵抗力较强，在4℃经几周，在-20℃经几个月，在-70℃经几年感染能力不受影响，在鲜鸡蛋中经几个月、在冻鸡中经2年仍有病毒存在。

碳酸钠和氢氧化钠对其消毒效果不理想，大多数除垢剂能将其迅速灭活，煤酚皂、甲酚配成2%-5%浓度可以在5分钟内杀死病毒。0.1%福尔马林37℃时6小时可以杀灭病毒。;（三）致病性;（四）培养特性;（五）微生物学诊断;一、口蹄疫病毒（FMDV）;本病毒是??物病毒中发现最早的一种。口蹄疫病毒属于：小RNA病毒科/口蹄疫病毒属；二十面体对称，直径20～25nm无囊膜，病毒基因组为正股单股RNA，在RNA芯髓外对称衣壳上有32个壳粒。电镜下观察，可见病毒粒子表面的颗粒状结构和一个密度较低的中心。此外尚可见有较小的蛋白质亚单位颗粒，直径7～8nm，无感染性。比较小的颗粒具有球蛋白特性。病毒子在宿主细胞的原浆内可形成晶格状排列。

;对酸敏感：病毒在pH为6.5的缓冲液中、4℃条件下14h灭活90％，在pH5.5时1min灭活90％，在pH5．0时每秒钟灭活90％，pH3．0时瞬间灭活，病毒在pH7.0～7.5时十分稳定。

对碱敏感；最常用的消毒液为1%NaOH。

对一般消毒剂的抵抗力较强；

耐低温：低温下能长期保存。病毒的灭活温度为85℃1min，70℃10min，60℃15min，但裸露的RNA对热较稳定。;各型之间没有相互免疫作用。本病毒有较大的变异性，病毒在保存和流行中，常发生血清学的变异，有时流行初期与末期毒型不一致，几乎每年都有新的亚型出现，本病毒已发现65个以上的亚型。;组织培养利用犊牛、幼猪的肾脏或豚鼠、牛胚胎上皮组织制成细胞单层来培养病毒，病毒繁殖后，使细胞发生病变。

鸡胚培养本病毒不易在鸡胚上生长，必须反复交替通过牛与鸡胚或在添有牛舌上皮的鸡胚组织培养继代后，才可能适应于鸡胚或鸡胚组织培养。;（五）致病性;猪口蹄疫;牛口蹄疫;心包膜弥漫性和点状出血，心包积液浑浊，心肌松软，切面有灰黄色或淡黄色斑点或条纹。;豚鼠接种试验：选择500g以上的健康豚鼠4～6只，剪去后肢足掌部被毛，用湿棉花球洗净，再用70％酒精棉消毒。将足掌部皮肤或口腔粘膜划破，把感染性病料涂擦于划破处。第二天如局部有水疱，即可确诊。

乳鼠接种试验：选2-7日龄乳鼠5只，4只做检样，1只做对照，每只颈背部皮下接种0.1ml，观察1周，如有死鼠,及时取出，制备1：3检样，传代。如无死鼠取活鼠冻死传代，传2-3代不死亡为阴性。

免疫学诊断法：间接血凝试验、中和试验、液相阻断ELISA。;本病康复后可获得坚强的免疫力，免疫期1～3年，能抗同型强毒攻击，但可被异型病毒所感染，并出现典型症状。猪的免疫期较短，仅有几个月。免疫和康复动物所产生的抗体有两种类型——早期型和晚期型。

人工自动免疫可用灭活苗或弱毒苗以及基因工程苗。人工被动免疫可用口蹄疫高免血清，高免血清也可用于早期治疗。;生物学特性：单股RNA病毒，有囊膜，