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第2章 醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究

第2章 醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究

引言

醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属[30]，又名醋酸细菌。醋酸菌的细胞一般为杆状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，大小一般在0.6～0.8×1.0～3.0μm。醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌，它有的细胞是周生鞭毛种类，一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端生鞭毛。醋酸菌的分布广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表面中都有生长[31]。醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。醋酸菌在发酵过程中，会产生大量的醋酸和其他有机酸，而且还有醇类[32]。

本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实验，并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册，做出进一步鉴定。

实验材料与方法

材料与仪器

分离样品：取自湖北某果醋厂发酵的醋醅。试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1.a。

表2.2.1.a主要仪器设备

Tab2.2.1.aMaininstrumentequipment

主要仪器生化培养箱

双目生物显微镜分析天平

手提式不锈钢蒸汽灭菌锅

超净工作台

精密数字式酸度计

型号

PYX-250S-ABME（BA/E3）BS224S

DSX-280BSW-CJ-1FDpHS-3C

厂家长沙科技科力仪器德国莱卡北京化丰上海南鹏上海科技

第2章

第2章

醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究

试验试剂：葡萄糖、酵母膏、甘油、无水乙醇(95%)、CaCO3、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl3、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯；琼脂食用级。

2.2.2 培养基[33-37]

表2.2.1.ｂ培养基成分表

名称葡萄糖酵母膏无水乙醇(v/v)

名称

葡萄

糖

酵母

膏

无水乙醇

(v/v)

琼

脂

CaCO

备注

⑴

基础发酵培养基

1%

1%

3%

pH4.5

⑵

分离培养

1%

1%

3%

2%

2%

pH自然

⑶

斜面保藏培养基

1%

1%

3%

2%

1%

pH自然

⑷

液体保藏培养基

1%

1%

1%

pH自然

⑸

改进后的斜面液体保藏培养基

1%

1%

3% 2% 1% pH自然

⑹

发酵培养基

1%

1%

7% pH4.5

⑺

Horyer-Frateur培养

3%

pH自然

基

⑻

GYC培养基

10%

5%

2%

2.5%

pH自然

⑼

高糖培养基

30%

1%

2%

2%

pH自然

⑽

生酮培养基

3%

2%

甘油3%

⑾

产5-酮基葡萄糖酸盐培养基

3%

1%

2%

2% pH自然

⑿

氧化乙酸培养基

1%

1%

乙酸钙1%pH

2%

7.2

⒀

氧化乳酸培养基

1%

1%

乳酸钙2%

2%

pH7.0-7.2

⒁

乙醇培养基

1%

3%

2% pH自然

3

注：培养基⑸在斜面保藏培养基⑵上，30℃培养24h，加入无菌碳酸钙，灌入并液体培养基到斜面上，至离管口2cm处，密封冷藏；培养基⑺其他成分有(NH)SO0.1%，

42 4

KHPO0.1%，KHPO0.01%，0.025%，FeCl0.0005%；以上培养基均以121℃灭菌20min。

2 4 2 4 3

醋酸菌的分离纯化

分离纯化实验

称取醋醅样品5g，液态增殖培养48h后，按照浓度梯度10-6、10-7和10-8，

涂布在分离培养基上，培养2d后，挑取平板上单个透明圈大的菌落。

连续在平板上培养3次，观察其菌落形态是否一致，选取透明圈又大又清晰的单菌落，转接并保藏于4℃的冰箱。

革兰氏染色实验

将上述活化后的菌株，接种于新鲜的培养基培养24h，制作水晶镜片进行革兰氏染色。

产醋酸定性实验[38]

取活化好的斜面菌种，分别接种于基础培养基中，并加入3%(v/v)的无水乙醇，32℃震荡培养60h，取少量除去菌体的培养液，用NaOH溶液（2.5mol/L）调节pH至7.0，加入5~6滴5%FeCl3溶液，产醋酸细菌会形成红褐色沉淀。

根据2.2.3.3试验和2.2.3.4试验结果，筛选出革兰氏阴性且产醋酸的细菌[39]

为醋酸菌。

醋酸定量实验

经过初步筛选后，把所得菌株接种至发酵培养基中，在32℃、140r/min恒温震荡培养60h后，检测其发酵液中总酸，每株平行3组。

醋酸定量测定[40]：

精确吸取发酵液2mL至250mL三角瓶中，并加入蒸馏水50mL，滴加1~2

滴0.5%的酒精酚酞溶液，用