(2.4)--多种蛋白质测量方法的优缺点对比分析.ppt

多种蛋白质测量方法

的优缺点对比分析;立题依据;研究内容与目标;Folin-酚测定法;实验基本原理

Folin-酚测定法是在双缩脲反应的基础上发展起来的，Folin-酚试剂是由甲、乙两种试剂组成的。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成，在碱性条件下蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐起作用，生成紫红色络合物；乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成，在碱性条件下，铜-蛋白质络合物以及蛋白质中的酪氨酸残基（酚基）和色氨酸还原磷钼酸-磷钨酸试剂（乙试剂）产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物），其色泽深浅与蛋白质含量成正比。可用500nm波长比色测定，适于测定蛋白质含量0.05～0.5g/L.

优点：简单、迅速、灵敏度高；反应较稳定。

缺点：该反应受多种因素的干扰。;1.蛋白质(肽键)

OHˉ甲试剂

(酒石酸钾钠铜盐)

生成紫红色络合物

蛋白质中的酪氨酸和色氨酸

紫红色络合物

OHˉ乙试剂

产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物）

;实验材料与试剂

1、实验材料：

待测样品（牛血清白蛋白）先用去离子水配成5g/L的溶液，作适当的稀释（做三份，1:10,1:20,1:50）

2、实验试剂：

⑴蛋白质标准溶液：0.5g/L牛血清白蛋白

⑵Folin-酚试剂

①甲试剂

②乙试剂

实验器材与仪器

1、试管及试管架，移液管；

2、可见光分光光度计及1cm玻璃比色皿；

3、恒温水浴箱(25℃）。;实验操作方法和步骤

制备Folin-酚法蛋白质标准曲线

取6支试管，编号1－6，按表1顺序依次加入各种试剂，并在分光光度计于500nm处测定光吸收值（A500nm值）。;表2;绘制标准曲线并计算

⑴绘制标准曲线：

以光吸收值（A500nm）为纵坐标，标准蛋白质含量（mg/L）为横坐标，在坐标纸上绘制蛋白质标准曲线。

⑵计算：

待测样品（牛血清白蛋白）三种稀释浓度下的光吸收值（A500nm），查蛋白质标准曲线得蛋白质含量，再进行待测样品最终蛋白质含量的计算。;BCA测定法;Bicinchoninicacid(BCA)法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu+。BCA与Cu+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。

与Lowery（福林酚）法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford（考马斯亮蓝）法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。;试剂：（1）

A液：分别称取2.50gBCA、5.00g碳酸钠、2.40g碳酸氢钠、1.00g氢氧化钠、0.40g柠檬酸三钠，适量水溶解，定容至250mL(pH11．25)。

B液：称取4．00gCuSO4·5H2O，用适量水溶解后定容至100mL，配成4％CuSO4溶液备用

（2）

BCA工作液：试剂A100mL+试剂B2mL，混合

（3）蛋白质标准溶液：0.5g/L牛血清白蛋白

（4）待测样品（牛血清白蛋白）先用去离子水配成5g/L的溶液，作适当的稀释（做三份，1:10,1:20,1:50）

;1、将BCA工作液与稀释后的待测样品混匀，于37°C放置保温30分钟，用562nm波长比色测定吸光度值。

2、将BCA工作液与标准蛋白质溶液混匀，以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。

3、用分光光度计光吸收值在标准曲线上查找相应的蛋白质含量，再计算出待测血清中蛋白质浓度（g/L)。

待测样品浓度在50～2000微克／毫升浓度范围内有较好的线性关系;实验操作方法和步骤

制备BCA法蛋白质标准曲线

取6支试管，编号1－6，按表1顺序依次加入各种试剂，并在分光光度计于562nm处测定光吸收值（A562nm值）。;表2;绘制标准曲线并计算

⑴绘制标准曲线：

以光吸收值（A562nm）为纵坐标，标准蛋白质含量（mg/L）为横坐标，在坐标纸上绘制蛋白质标准