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蛋白质分离纯化方法的研究进展

蛋白质存在于自然界中复杂的混合体系中，许多重要的蛋白质在细胞中的含量极低。要把蛋白质从复杂体系中分离出来，同时要防止其组成、结构的改变和生物活性的丧失，有相当的难度。蛋白质的分离纯化是研究蛋白质的结构、化学组成及生物功能的基础。目前蛋白质分离纯化技术的发展趋向于精细而多样化技术的综合运用，但其基本原理均是以蛋白质的性质为依据的。破碎组织细胞，提取蛋白质的混合物，利用各种沉淀法对蛋白质进行粗提；层析和离心技术则可对粗提蛋白质进行进一步的纯化，实际工作中应按不同的要求和条件选用不同的方法。

1、蛋白质的预处理

分离纯化蛋白质首先要将蛋白质从原来的组织中释放出来,并保持原有的天然状态,不丢失活性物质。因此,根据分离纯化蛋白质的原料不同,采取不同的方法进行预处理。例如,植物组织和细菌要将细胞壁进行破碎，动物材料要去掉结缔和脂肪组织。破碎细胞主要采取超声波振荡、研磨、高压挤压或酶处理等方法。组织和细胞破碎后,选择适当的缓冲液将目的蛋白质提取出来,细胞碎片等不溶物质则用离心或者过滤的方法除去。近年来酶在蛋白质分离纯化中的应用非常广泛。在一般条件下,碱性蛋白或者碱性酶、肽类在酸性环境下比碱性环境稳定,反之亦然。因此,在利用酶对蛋白质进行预处理时,要选择合适的酶以及操作环境,以达到较好的提纯效果。

2、蛋白质的分离纯化方法

2.1沉淀法

2.1.1盐析沉淀法盐析沉淀法是根据不同蛋白质在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法，是蛋白质和酶提纯工艺中最早采用,且至今仍广泛应用的方法。蛋白质易溶于水，因为其分子的-COOH、-NH2和-OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1～100nm大小的亲水胶体，从而削弱了蛋白质分子之间的作用力。蛋白质分子表面亲水基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力就越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个，即电荷和水化膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4）有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。

2.1.2等电点沉淀法利用蛋白质在等电点时溶解度最低，而各种蛋白质具有不同的等电点来分离蛋白质的方法，称为等电点沉淀法。蛋白质的等电点(pI)即蛋白质的净电荷为零时的pH值，由于等电点时蛋白质的净电荷为零，失去了水化膜和分子间的相斥作用，疏水性氨基酸残基暴露，蛋白质分子相互靠拢、聚集，易形成沉淀析出。

2.1.3有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法的原理是:与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇等)能使某些蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下,有机溶剂不仅能够引起蛋白质的沉淀,而且伴随变性。因此,通常要将有机溶剂冷却,然后在不断的搅拌下加入有机溶剂以防止局部浓度过高,蛋白质变性问题就可以很大程度上得到解决。用此法析出的沉淀一般比盐析法易过滤或离心沉降。分离后的蛋白质沉淀应立即用水或者缓冲液溶解，以达到降低有机溶剂的浓度的目的。

2.2层析(chromatography)

2.2.1离子交换柱层析离子交换层析(Ionexchangechromatography,IEC)是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中,基质由带电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的为阴离子交换树脂;反之，则为阳离子交换树脂。当蛋白质处于不同的pH值条件,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,反之，阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白,结合的蛋白通过提高洗脱液的盐浓度,被留在层析柱上,可以通过逐步增加洗脱液的盐浓度或提高洗脱液的pH值将吸附在层析柱上的蛋白洗脱下来,以用于蛋白质的分离纯化。一般情况下,粗胶粒的离子交换剂用在提纯的前面步骤中,高分辨率的离子交换剂则用在纯化的后面步骤中。

2.2.2疏水相互作用层析多数疏水性氨基酸残基藏在蛋白质的内部，也有一些在表面。蛋白质表面的疏水性氨基酸残基数目与空间分布决定了该蛋白质是否具有与疏水柱填料结合从而利用它来进行分离的能力。高浓度盐的水溶液中蛋白在柱上保留，在低盐或水溶液中蛋白从柱上被洗脱，因此特别适用于浓硫酸铵溶液沉淀分离后的母液以及该沉淀用盐溶解后含有目标产品的溶液直接加样到柱上，也适用7mol/L盐酸胍或8mol/L脲的大肠杆菌治疗蛋白提取液直接加样到柱上，在分离的同时也对其进行了复性。疏水层析具有较少使多肽变性的特点。

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