第四组实验血清GPT活性测定.pptx

血清谷丙转氨酶活力的测定（改良赖氏法）

实验目的实验原理实验试剂实验操作

实验目的1.了解血清谷丙转氨酶活力单位的定义。2.掌握血清谷丙转氨酶活力测定的方法及临床意义。

临床意义谷丙转氨酶，又名谷氨酸转氨酶(GPT)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)。肝脏是人体最大的解毒器官，该脏器是否正常，对人体来说是非常重要的，GPT升高是肝脏功能出现问题的一个重要指标。GPT主要存在于肝细胞浆内，其细胞内浓度高于血清中1000-3000倍。只要有1%的肝细胞坏死，就可以使血清酶增高一倍。因此，GPT被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。但它并不具器官专一性，许多疾病都可以引起它的增高，明显升高见于急性病毒性肝炎，中度升高见于慢性肝炎、肝硬化活动期、肝癌、肝脓肿，心梗、心肌炎、心衰等也可轻度升高。部分GPT升高与脂肪肝、饮用酒精有关。临床常用的保肝药物较多。有些药物的治疗效果较好但容易反复，致使一些肝脏疾病长期不能治愈，大量的肝细胞遭受破坏。如何保护肝细胞，是保护肝脏功能的关键所在。谷丙转氨酶的正常参考值为5～40U/L

背景知识转氨基作用：指的是在转氨酶的催化下，可逆地把α-氨基酸的氨基转移给α-酮酸，结果是氨基酸脱去氨基生成相应的α-酮酸，而原来的α-酮酸则转变成另一种氨基酸。

GPT活力测定的不同方法一.卡门氏分光光度法，测定的是酶促反应速率。其原理如下：由于NADH在波长340nm处有特异吸收峰，因此ALT的活性可通过NADH的减少量，亦即通过340nm吸光度的减少量间接作出定量测定。这一方法特异性、准确性高。但是此法除要加入待测酶ALT的底物外，还需要加入指示酶LDH及其辅酶NADH，又需用紫外分光光度计，因此不易为一般临床化验室推广。二.比色测定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun法）和赖氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全相同。不同之处在于作用时间：金氏法60min、穆氏法和赖氏法30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。

本次实验的方法：改良赖氏法卡氏测定ALT活力的原理:丙氨酸+α-酮戊二酸ALT谷氨酸+丙酮酸丙酮酸+NADH乳酸脱氢酶乳酸+NAD+赖特曼改用2.4-二硝基苯肼与丙酮酸显色测定丙酮酸含量，故称为赖氏法。改良赖氏法继承了赖氏法的测定方法与卡门法的酶单位定义，用赖氏法的分光光度数据与对应的卡门单位数作标准曲线，对比测定酶的活性，结果比较准确。

GPT酶活力单位的定义卡门氏单位定义为：1ml血清(反应溶液总量为3ml)，在25℃，1min内生成的丙酮酸，在乳酸脱氢酶催化下，使NADH+H+变成NAD+，在340nm波长下，用内径为1.0cm的吸收池，光密度每下降0.001为1个氨基转移酶活力单位。金氏法单位定义是：每1ml血清在37℃条件下与底物作用60min，生成1μmol丙酮酸称为一个单位。穆氏法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37℃条件下与底物作用30min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。赖氏法没有制定自身的单位定义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。

实验原理血清中的谷丙转氨酶（GPT），在37℃、pH7.4的条件下，可催化底物液中的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸

生成的丙酮酸与2,4-二硝基苯肼作用，产生丙酮酸2,4-二硝基苯腙，后者在碱性环境中呈现红棕色，颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比。根据丙酮酸的生成量，即可计算GPT活性的大小。

实验试剂1.GPT底物液(2mmol/Lα-酮戊二酸，20mmol/LL-丙氨酸)称取分析纯α-酮戊二酸29.2mg，L-丙氨酸1.78g,先用50ml磷酸缓冲液(pH7.4)溶解，然后用1mol/LNaOH校正pH至7.4(约0.5ml)，再以pH7.4的磷酸缓冲液稀释至100ml，加氯仿数滴，防止变质。2.磷酸缓冲液（PBS0.1mol/LpH7.4）称取Na2HPO413.97g，KH2PO42.69g，溶解于dH2O中，稀释至1000ml。3.丙酮酸标准液（2.0mmol/L）取标准丙酮酸钠22mg，用磷酸缓冲液准确定容为100mL。此液须当日用当日配。4.2.4-二硝基苯肼溶液(1mmol/L)称取2,4-二硝基苯肼19.8mg，先溶于10mL10mol/LHCL中，溶解后加水至100mL。5.0.4mol/LNaOH.

实验操作1.标准曲线绘制:(1)取试管5支，按表6-8操作。(2)混匀，室温放置10min后，以蒸馏水调零，用520nm波长