产吨中性淀粉酶发酵工艺设计方案.docx

前言

淀粉酶属于水解酶类，是水解淀粉和糖原的酶类总称。通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的退浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法、碱法更松软，且不损伤纤维。此类酶广泛存在于动、植物和微生物中，几乎全部动物、植物和微生物都含有淀粉酶。

淀粉酶是争论较多、生产最早、产量最大和应用最广泛的—类酶。特别是20世纪60年月以来由于淀粉酶在淀粉糖工业生产和食品工业中的大规模应用，它的需要量与日俱增，到目前为止，其产量几乎占到整个酶制剂的50％以上，销售金额占到55％～60％。依据水解淀粉的方式不向，主要的淀粉酶有α—淀粉酶、β—淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脱支酶、环糊精葡萄糖基转移酶等。

淀粉酶已经成为工业应用中最为重要的酶之一，并且大量的微生物可以用以高效生产淀粉酶，但是酶的大规模商业化生产仍旧局限于几种特定的真菌和细菌中。对于高效的淀粉酶的需求越来越多，这可以通过对现有酶的化学改进或者通白质工艺改进得到。得益于现代生物技术的进展，淀粉酶在制药方面的重要性日益凸显。固然，食品和淀粉工业仍旧是主要市场，淀粉酶在这些领域的需求仍旧是最大的。

中性淀粉酶是目前使用最广泛的一种酶，主要运用于发酵、食品、医药、纺织及造纸工业。就我国而言一般承受液态深层发酵法生产，但发酵水平低，过滤困难，使其进展受到了较大的限制。

本课题中以枯草杆菌为试验菌株，承受液体摇瓶发酵，并在培育基中添加发酵助剂如Na＋和Tween—80等来提高酶活。

枯草芽孢杆菌可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌。枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，可在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用。枯草芽孢杆菌广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中生殖。

菌种的选育

菌种的选育及制备

微生物是各种生物活性产物的丰富资源。在发酵前期，微生物的选择至关重要，我们此次设计的是利用枯草芽孢杆菌发酵生产中性蛋白酶的整体过程。

选择性分别的步骤一般是：

含微生物材料采集——标本材料的预处理——菌种的分别——富集培育—

—菌种初选——菌种复选——性能鉴定——菌种保藏。

含微生物材料的选择

土壤是微生物聚拢最丰富的场所，菜园和农田耕作层土壤含有丰富的有机物常以细菌和放线菌居多，由于枯草芽孢杆菌生活在中性的环境中，可以采集中性的土壤。采土时先用小铲除去表土，取5～15㎝深处的土样，选好3～5点，每点取土10g混在一起装入灭过菌的牛皮纸袋，并记录时间、地点、植被等状况。

预处理

在培育过程中以淀粉作为唯一或主要碳源，掌握pH在6.7～7.2。那些在所承受的条件下最适用于淀粉代谢的微生物最终将占优势，并可在淀粉琼脂糖平板上分别到产生中性淀粉酶的菌株。

所需菌种的纯化和分别

可用平板划线法进展菌种分别。方法如下：用接种管蘸取少量经增殖培育后的菌液，在含无菌固体培育基的平板外表上进展规章划线，操作时由右向左轻轻划线，划线时平板面与接种环成30°～40°，以手腕力气在平板外表轻松滑动划线，线条要平行密集，使两线不能重叠，充分利用外表积，划线时接种环不要嵌入板内划破培育基，密集的含菌样品，经过多划线稀释，使菌体在平板培育基上渐渐分别成单个菌株，经培育生殖成单个菌落，反复进展几次平板划线分别，可得枯草芽孢杆菌野生菌株。

菌株的培育

常用培育基配方：1L蒸馏水+10g蛋白胨+3g牛肉膏+15～20g琼脂

+5gNaCl。本课题以麸皮、豆饼粉作为自然培育基，在37℃保温箱中培育，至培育基中局部消灭成熟颜色即可进展保藏。

菌落的选择

初筛承受透亮圈法，方法为在培育基里接入淀粉天青，接入含菌样品后，可在菌落四周清楚地观看到淡蓝色晕环，初筛选出的微生物经过菌株性状试验后已确定具有肯定生产力量的菌株还要进展复筛。

方法：将初筛后的少数菌株接种于40ml锥形瓶内的液体培育基中，110次

/min往复式摇床式震荡培育，得到摇瓶种子。

诱变育种

诱变育种可以利用物理、化学因素诱导遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求如高产的个体，进而培育成的品种或种质。

诱变育种操作程序如下：

动身菌株→纯化→培育液→细胞或孢子悬液→诱变剂处理→中间培育→平板分别→初筛→复筛→生产性能试验→菌种保藏。

动身菌株的选择

由于野生型菌株生产性能较差，通常承受经受过生产条件考验的菌株，即经过液体培育的摇瓶种子，这类菌株肯定的生产性状，对生产环境有较好的适应性，正突变的可能性也很大。

菌悬液的制备

细菌一般要求处于对数生长中期的菌，用玻璃珠振荡5min，使细胞均一分散，然后用灭菌脱脂棉过滤，得到分散菌株。菌悬液的细胞浓度不宜过高，本课题中的枯草芽胞