朱鹮大肠埃希菌PCR检测技术规程.pdfVIP

朱鹮大肠埃希菌PCR检测技术规程

1范围

本标准规定了朱鹮大肠埃希菌（Escherichiacoli）的PCR检测方法。

本标准适用于朱鹮泄殖腔拭子、粪便、感染组织等样品中大肠埃希菌的鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

标准。

GB19489实验室生物安全通用要求

SN/T2025动物检疫实验室生物安全操作规范

SN/T2984检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则

3术语和定义

下列术语、定义和缩略语适用于本文件。

术语和定义

3.1.1大肠埃希菌Escherichiacoli

为革兰氏阴性细菌，短杆状，周身鞭毛，无芽孢，无荚膜，能运动，兼性厌氧。

缩略语

下列缩略语应用于本文件。

PCR:聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）

DNA:脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）

dNTP:脱氧核苷酸三磷酸（Deoxyribonucleosidetriphosphate）

4试剂、材料及设备

缓冲葡萄糖黄绿胆盐肉汤（EE肉汤见附录A）。

可调移液器：2.5μL、10μL、100μL、1000μL。

恒温培养箱。

电泳仪。

凝胶分析成像系统。

1

无菌试管：18mm×180mm。

超净台。

冷冻离心机。

细菌基因组DNA提取试剂盒。

琼脂糖(电泳纯)。

DNA分子量标志物（100-2000bp）。

GelRed或GelGreen核酸染色剂。

琼脂糖(电泳纯)。

6×上样缓冲液:30mmol/LEDTA、36%(体积分数)甘油、0.05%(质量浓度)二甲苯腈蓝FF、

0.05%(质量浓度)溴酚蓝。

50×TAE缓冲液（见附录B）

Eppendorf管和PCR反应管。

电子天平。

恒温培养箱。

冰箱。

精密pH试纸。

5PCR鉴定

样品增菌

接种环挑取少许病料，接种于10mLEE肉汤中，150rpm，37℃振荡培养18h～24h。

DNA提取

从增菌后的EE肉汤中取出1mL转移至无菌离心管中，在4°C下以13000rpm离心5min。弃去上

清液，将沉淀悬浮于100μL无菌蒸馏水中,按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明进行提取（若不能及

时检验，则放置于-20℃冰箱保存备用），提取后的DNA使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测量260

nm和280nm处的吸收值并记录。

PCR扩增

以25μL反应体系进行扩增，其中包括10×PCRbuffer2.5μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.5

μL，上下游扩增引物(10mmol/L)各1uL，dNTPs(10mmol/L)1μL，模板DNA1μL(可根据模板DNA

的质量调节)，蒸馏水补足体积至25μL。反应条件为94°C预变性1min，94°C变性1min，55°C退火

45s，72°C延伸1min，进行30个扩增循环，最后在72°C下延伸7min。

2

反应体系对照设置

PCR反应体系分别设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照为大肠埃希菌DNA模板，阴性对

照为非大肠埃希菌DNA模板，空白对照为灭菌蒸馏水。