血液科研究生系列讲座之一流式.ppt

FACSCalibur流式细胞仪原理及应用杨远2011年6月7日BD公司介绍位居财富周刊500强的大型跨国公司产品涵盖诸多医疗领域生物科学部:流式细胞仪及应用于生物科学的试剂、耗材BD公司流式细胞仪产品FACSVantageSE-大型分选机BD公司流式细胞仪产品流式细胞仪可以告诉我们什么？细胞表面抗原胞内抗原核内抗原核酸分泌蛋白流式细胞仪的检测范围什么是流式细胞仪？在流动的状态中检测细胞各种物理及生物特征的一种仪器；流式细胞仪检测原理流式细胞仪的特征流式细胞仪优势灵敏度高速度快多参数分析（可同时标记多种荧光素）单细胞水平上分析可分析大量细胞需要样本量少出结果较快标本来源广：全血样本、骨髓、组织、培养细胞、穿刺物、胸水、腹水、灌洗液、脑脊液、眼泪、乳汁、血清/血浆、细胞裂解液FACSCalibur-临床科研型流式细胞仪双激光立体激发488nm/635nm四荧光六分析参数灵敏度：〈200FITCDDM双联体识别模式分析速度快自动化程度高设计灵活细胞分选系统 FACSCalibur结构组成液流系统将细胞引导至检测点光学系统产生并收集光学信号电子系统将光信号转换成电信号，使之数字化，输入计算机并分析分选系统（选配）液流系统流动室鞘液酸碱平衡的电解液，可选PBS、血球稀释液.样本流单细胞悬液液流系统

-FLOWCELL(流动室)液流系统-鞘液液流系统-样本流光学系统光学激发系统激光激光(Laser,lightamplificationbystimulatedemissionofradiation)是一种相干光源，它能提供单一波长、高强度及稳定性高的光照488nm，635nm光学信号光学收集系统光学滤片透镜光学信号信号产生-散射光信号当颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。前向角散射光信号（FSC）:与激光束方向同轴的称前向角散射光信号。表示细胞或颗粒大小的不同。侧向角散射光信号（SSC）:与激光束垂直的称为侧向角散色光信号。表示细胞或颗粒内部的复杂程度或颗粒性的不同。光学信号信号产生-荧光信号当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返回基态时，染料释放出能量，大部分以光的形式释放。这种发射出的光称为荧光。荧光染料的特性光学信号荧光信号光学信号常见荧光染料的发射波长光学信号荧光染料的选择荧光染料的激发波长荧光染料的发射波长荧光信号的强弱光学收集系统FCM的光学系统是由若干组透镜,滤波片,小孔组成光学收集系统滤片长通滤片（LP）：长于设定波长的光通过，并反射短于设定波长的光光学滤片-短通滤片流式细胞仪滤片带通滤片（BP）：允许一定带宽波长的光通过。光学系统常用荧光染料的特性常用荧光染料(488nm,633nm激发)FluoresceinIsothiocyanate(FITC)异硫氰酸荧光素Phycoerythrin(PE)藻红素Allophycocyanin(APC)异藻蓝蛋白Peridinin-ChlorophyllProtein(PerCP)多甲藻黄素-叶绿素蛋白TandemDyesPE-TexasRed(ECD)PE-Cy5(PC5)PE-Cy5.5(PC5.5)(futures)PE-Cy7(PC7)(futures)电子系统当细胞携带荧光素标记物,通过激光照射区时,受激激发,产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号,这些信号经A/D转换成数字信号,送计算机进行储存、作图、统计分析检测器Photomultipliertube(PMT)将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号几个概念信号放大PMT将光信号转换成电信号，调整PMT的电压，信号强度将随之改变。阈值信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将不需要的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。几个概念颜色补偿采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差。在完成双色以上荧光标记的样本时，都需要作颜色补偿。几个概念颜色补偿带通滤片接受的是一定带宽波长的荧光，故会有干扰光同时被接收，然后一同进入PMT进行光电转换并放大。通常用干扰光占该染料所发出荧光总量的X%表示补偿模型图颜色补偿判断标准未作颜色补偿颜色补偿判断标准补偿后