细胞鉴定分析和总结.docxVIP

成骨细胞鉴定：

Giemsa染色：

将纯化后的第2代细胞调整细胞浓度至5×107

L-1，接种到12孔细胞培养板中，

每孔接种0.75mL，以后每3d换液。待细胞分布均匀、约80%融合时，PBS洗3次，

甲醇固定10min，Giemsa染液染2min，蒸馏水冲洗，显微镜下观察拍照。

碱性磷酸酶活性检测细胞化学染色：

细胞接种方法同上，体积分数95%乙醇固定30min，按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。核固红复染细胞核，自然干燥后中性树胶封固。阳性细胞可见蓝黑色颗粒沉积在胞浆碱性磷酸酶活性部位。

钙化结节染色(茜素红法)：

细胞接种方法同上，弃培养基，培养板用PBS冲洗2次，体积分数95%乙醇固定30min，蒸馏水冲洗3次，0.1%茜素红[茜素红-Tris-Hcl(pH8.3)]染色，37℃，30min，蒸馏水冲洗。低倍镜视野(×40)下进行矿化结节观察。

VonKossa’s矿化结节染色法：

细胞接种方法同上，弃培养基，培养板用PBS冲洗2次，40g/L多聚甲醛固定标本，5%硫代硫酸钠孵育30min，蒸馏水冲洗，然后用1%硝酸银溶液紫外线下染色30min，蒸馏水冲洗掉浮于细胞表面的黑色物质，继续用5%硫代硫酸钠染色2min，1%中性红复染10min，蒸馏水漂洗后观察。

成骨细胞扫描电镜表面形态观察：

培养24h后取出预先置培养板内的圆盖玻片(直径9mm)，用PBS冲洗3次，加入3%戊二醛固定2h；用PBS冲洗3次，45min/次。加入1%锇酸，固定2h。体积分数为50%，70%，80%，90%，95%的乙醇逐级脱水，各15min；体积分数100%乙醇脱水2次(15min/次)。醋酸异戊酯15min。CO2临界点干燥，黏附于载物台上真空镀膜仪镀金，扫描电镜观察并摄片。

成骨细胞透射电镜超微结构观察：

消化收集细胞，1000r/min离心5min弃上清；前固定：加入预冷的固定液3%戊二醛固定2h。漂洗：弃戊二醛，将细胞团块挑出，包入擦镜纸内， 装入小瓶中，加入PBS过夜。去除液体，PBS漂洗，重复3次(每隔15min1次)。后固定：清洗后，加入1%锇酸固定3h。漂洗：弃去锇酸，加入0.1mol/L的PBS漂洗，步骤同上。乙醇逐级脱水，丙酮浸透。包埋，修块，切片，醋酸铀-柠檬酸铅双染，透射电镜观察并摄片。

生长曲线测定：

将生长状态良好的SD乳鼠成骨细胞传至96孔培养板，接种密度5×103/孔，将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、体积分数5%CO2及饱和湿度条件下培养。每孔加入MTT溶液(5g/L)20μL，37℃孵箱中继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150μLDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值

为纵轴绘制细胞生长曲线。

主要观察指标：

主要观察成骨细胞的形态、试剂及仪器来源H-DMEM培养基、胎牛血清胰蛋白酶、青霉素、链霉素、Ⅱ型胶原酶H-500型透射电子显微镜JSW-T300扫描电镜SW-CJ型生物洁净工作台CO2培养箱倒置相差显微镜。大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定成骨细胞特征性染色、超微结构及生长曲线。

破骨细胞鉴定：

形态观察:破骨细胞含多个核,经HE、Giemsa染色光镜观察一般含5～20个核;噬骨实验即骨片上形成骨吸收陷窝是破骨细胞鉴定的重要标准,因为与破骨细胞类似的巨噬细胞无此功能,骨片的制备可利用新鲜牛股骨皮质骨,用金刚砂片切割成薄片,再用金刚砂石和磨玻璃磨成约10厚、6mm×6mm薄片,经超声波清洗后置

199培养液中浸泡待用。骨吸收陷窝观察被用来评价体外培养破骨细胞骨吸收功能, 以往多在扫描电镜下进行陷窝计数,采用1%甲苯胺蓝染色,利用骨吸收陷窝计数光镜法和计算机图象分析系统,可较为全面评价骨吸收功能,计数结果与电镜法具有良好的相关性;

抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色:抗酒石酸酸性磷酸酶为破骨细胞胞浆中所特有酸性磷酸酶,具体方法是:将细胞爬片置于37℃烘箱中烘5min,用2.5%体积分数的戊二醛4℃固定

10min,同时温育孵育液(六偶氮副品红0.2ml,0.1mol/L醋酸钠缓冲液38ml,2ml奈酚AS-BI磷酸盐溶液,0.388g酒石酸钾钠,pH5.0)至3