彗星分析实验：单细胞凝胶电泳.pptVIP

7.观察、拍照和分析：置荧光显微镜下，拍照用专用的软件进行分析。实验步骤彗星的测量尾长，彗星头部中心到尾部最远端的距离。尾长只在相对低的损伤水平增加，随后损伤剂量增加时，尾部光密度增加，而尾长不变彗星分析实验

（单细胞凝胶电泳）

(Singlecellgelelectrophoresis,SCGE)实验目的了解单细胞凝胶电泳的基本原理、操作方法及其应用领域熟悉单个细胞DNA损伤所出现的彗星图像的观察与分析单细胞凝胶电泳1984年，Osting、Johanson首先提出的微电泳技术;1988年，Singh、Olive等进一步完善为单细胞凝胶电泳(singlecellgelelectrophoresis,SCGE);SCGE是一种在单细胞水平上检测DNA链损伤的方法,因其细胞电泳形态颇似彗星，又称彗星试验（cometassay）基本原理将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶中，经裂解处理后，再在电场中进行短时间的电泳，并用荧光染料染色，受损细胞中形成的DNA片段在电场中泳动速度较快，使细胞核呈现出一种彗星式的图案，而正常的无DNA断裂的核在泳动时保持圆球形。基本原理有核细胞核纤层为DNA提供锚定位点基本原理用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液的作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏，细胞内的RNA、蛋白质及其它成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，但核DNA仍保持缠绕的环区附着在剩余的核骨架上，并留在原位。如果细胞未受损伤，电泳时，核DNA因其分子量大停留在核基质中，荧光染色后呈现圆形的荧光团，无脱尾现象。基本原理若细胞受损，在碱性电泳液（pH13）中，DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断链或碎片离开核DNA向阳极迁移，形成拖尾。基本原理细胞核DNA受损伤越严重，产生的断链就越多，片段也越小，电泳表现为尾长增加和尾部荧光增强。因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定单个细胞损伤的程度。基本原理灵敏、快速地检测DNA损伤；适用于各种有核细胞。基本特点实验步骤制备单细胞悬液；制片/制胶；细胞裂解；DNA碱解旋；电泳；中和、染色；观察、拍照、分析。实验步骤1.制备单细胞悬液：培养的贴壁细胞：吸去培养液，放入到EP管中；向培养皿中加入PBS洗涤1次;加入胰酶（约100-200μl）进行消化，当细胞收缩变圆时，加入上述含血清的培养基，终止消化。吹打，收集到EP管中；离心(500~1000rpm,3min)，弃上清；加入1mlPBS，重悬离心，弃上清，用100μlPBS重悬，调整密度为1×104-5个/ml2.制片：有3种类型：（1）“三明治”凝胶：在磨毛玻璃上铺第一层正常熔点琼脂糖，第二层为细胞悬液与低熔点琼脂糖混合液，第三层为低熔点琼脂糖；（2）双层凝胶：不铺上述第三层凝胶；（今天选用）（3）单层凝胶：为改善琼脂糖凝胶易与玻片分离的缺点，在玻片上制一凹槽进行单层灌胶。实验步骤2.制片：第1层凝胶的制备用胶布将载玻片封边将适量（300～350μl）0.5%的NMA浇注到玻片上使胶均匀展开，室温固化10min实验步骤2.制片：第2层凝胶的制备将细胞与0.7%LMA混合均匀（体积比1/9）迅速将适量（100～200μl）含细胞的LMA滴到第1层琼脂糖上，室温固化10min实验步骤3.细胞裂解：将玻片置于平皿中，轻轻加入预冷的新鲜配置的细胞裂解液。4℃下避光裂解2-3h；取出载玻片用PBS漂洗2次（要求动作轻柔，以免琼脂糖脱落）实验步骤3.细胞裂解：裂解液（4℃保存，不宜久存）：2.5mol/LNaCl100mmol/LNa2EDTA10mmol/LTris-Cl1%十二烷基肌氨酸钠使用前加入：1%TritonX-10010%DMSO用NaOH调pH至10。实验步骤4.DNA碱解旋：将载玻片置于水平电泳槽；倒入新配制的电泳缓冲液，没过载玻片胶面；室温放置20－30min（避光），以便使DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段，使DNA断链在电场中易于迁移。实验步骤5.细胞电泳