分子生物学-蛋白质的研究方法.ppt

第五节蛋白质的免疫印迹分析印迹技术(blotting)是指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术1975年，EdwenSouthern提出了分子印迹(渍)的概念目前这种技术已被广泛用于DNA、RNA和蛋白质的检测印迹技术的类别及应用DNA印迹技术(Southernblotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析RNA印迹技术(Northernblotting)用于RNA的定性定量分析蛋白质的印迹分析(Westernblotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究由于蛋白质常用抗体来检测，因此也被称为免疫印迹技术(immunoblotting)一、免疫印迹分析的应用对蛋白质进行定性分析对蛋白质进行半定量分析信号转导分析生物大分子相互作用分析蛋白质元素组成的特点各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数×6.25×1001/16%1.紫外光谱(A280)吸收法这一方法可用来快速检测溶液中是否含有蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋白质的洗脱峰原理色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法芳香族氨基酸的紫外吸收优点快速缺点核酸可引起强干扰作用芳香族氨基酸含量差异可以起误差对蛋白质无破坏性不是严格的定量，适用于测定蛋白质粗提液计算方法标准曲线法蛋白质浓度(mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260注意事项石英比色杯调零所用溶液配制标准蛋白所用溶液光密度范围2.考马斯亮蓝G-250检测法这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质含量的方法原理该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物在595mn波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测595mn的光吸收值大小计算蛋白的含量所需时间10min优点快速（反应时间仅需2min）敏感缺点用这种测定方法对蛋白质引起不可逆的变性对各种纯化蛋白质反应不同计算方法标准曲线法注意事项反应10～15min后开始出现沉淀，尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条件下易发生沉淀若选用目的蛋白来做标准曲线或用另一种方法来校正，所测蛋白浓度较准确3.Lowry检测法这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已得到广泛应用.原理首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin-酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的复合物在745～750nm处有最大的吸收峰，颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比，可根据750nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量优点一种可靠的蛋白质定量方法不同蛋白质之间差别很小缺点某些试剂不稳定使蛋白质发生不可逆变性计算方法标准曲线法注意事项在加入试剂30min后呈色达到饱和，时间延长颜色信号减弱许多干扰物质降低颜色反应高盐浓度可引起沉淀4.BCA(二喹啉甲酸)检测法这是近年来新研制的一种改进的Lowry测定法原理在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu2＋生成络合物，同时将Cu2＋还原成Cu＋。而BCA试剂可敏感特异地与Cu＋结合，形成稳定的有颜色的复合物，在562nm处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量优点检测敏感性高缺点蛋白质发生不可逆的变性终产物稳定巯基试剂和去垢剂干扰第三节蛋白质相对分子量测定分子量测定(molecularweight,MW)凝胶层析沉降平衡超速离心动态弹性光散射孔径梯度电泳（SDS）质谱(ESI-MS)一、SDS测定蛋白质的相对分子量