分子生物学-聚合酶链式反应技术及应用.ppt

*(三)单链构型多态性分析法（PCR-SingleStrandConformationPolymorphism，简称PCR-SSCP）本法就是将PCR产物双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA（ssDNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于DNA分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与ssDNA序列有关。因此，电泳结束后，ssDNA带位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。*PCR-SSCP过程---------------------------primer---------------------------↓32P-dNTP掺入PCR扩增产物↓变性↓单链DNA↓中性聚丙烯酰胺凝胶电泳?↓12345自显影↓1.为正常结果分析2、4、5纯合患者3.为杂合子.解链构像DAN原理过程*优点及作用：方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，适合临床实验的需要。该方法和其他方法相比有较高的检测率。首先，它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变。经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发现，另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯。用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段。不足之处：只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序；电泳条件要求较严格；另外，由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。*(四)核酸探针杂交法(1)点杂交（dotblot）(2)反向点杂交（reversedotblot）(3)微孔板夹心杂交（microplatehybridization）(4)荧光探针杂交(5)Southern印迹杂交（Southernblot）*样品正对照负对照标准分子量污染是PCR实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过某个片段，就有可能以后的实验中发生污染。因此，做实验的时候绝对不要忘了负对照。用紫外灯破坏污染物也是一个办法5.PCR常见问题及分析*(1)假阳性①PCR产物是最主要的污染源。②阳性对照的污染。③标本之间的交叉污染。④在采集标本时，其他污染源带来的污染。⑤使用