传代细胞的常规培养.docx

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当原代培育成功以后，随着培育时间的延长和细胞不断分裂，一方面由于细胞密度过大，细胞与细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停顿；另一方面也会因养分物枯竭和代谢物积存而不利于生长或发生中毒。因此需要将培育细胞进展分别扩大培育，细胞由原培育瓶内分别稀释后传到的培育瓶的这个过程称为传代(passage)或者再培育(subculture)。

传代标准

传代时间一般通过两个方面进展确定：一是在细胞培育过程中，当培育液由于pH值下降而呈现黄色时，说明细胞已经到达最大密度，需要换液或进展传代培育；二是观看细胞形态，安康细胞形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。初代培育的首次传代很重要，是建立细胞系的关键时期。在首次传代时一般要特别留意以下3点：

①细胞没有生长到足以掩盖瓶底壁的大局部外表之前，不要急于传代。

②原代培育时细胞多为混杂生长，上皮样细胞和成纤维样细胞并存的状况很常见。传代时不同的细胞有不同的消化时间，因此要依据需要，留意观看准时进展处理，并可依据不同细胞对胰蛋白酶的耐受时间不同而分别和纯化所需要的细胞。另外早期传代的培育细胞较已经建系的培育消化时间相对较长。吹打细胞时动作要轻松，尽可能削减对细胞的损伤。

③首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能尽快适应环境有利于细胞生存和增殖。随消化分别而脱落的组织块也可一并传人的培育瓶。

生长周期和传代比例

体外培育技术中所谓的传“代”概念并不等于细胞生物学中“亲代细胞”与“子代细胞”中“代”的概念。传代培育的实质就是分别后再次培育，进展一次分别再培育称之为传一代，传代数可以衡量培育物的培育年龄。

传代是细胞分裂造成的结果，细胞从一次分裂完毕到下一次分裂完毕为一个细胞周期，分为间期与分裂期两个阶段。细胞周期能准确表示细胞增殖速度。两次细胞分裂之间的时间也可以用细胞世代时间来表示，所以细胞周期指细胞一个世代所经受的时间。正常细胞培育的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。

传代代数与细胞的世代数(增殖代数)并不是同一个概念。在细胞培育时，所说的

“第6代细胞”指细胞已经传代6次。以贴壁细胞为例，每传代一次，或许要倍增3～6次，细胞要经受如下生长过程：游离期、贴壁期、埋伏期、对数生长期和停顿期(平台期)。当细胞到达平台期时，就要进展传代培育，否则细胞会中毒，发生形态转变。甚至死亡。

培育细胞有密度依靠和接触抑制的特点，细胞浓度过低，不易存活，表现为细胞在到达增长前有较长的滞留期；细胞浓度过高，发生接触抑制后生长缓慢甚至死亡，所以传代比例通常按1:2～1:4的稀释度进展。传代后细胞的接种浓度一般为5×10的5次方/mL。

细胞传代方法

概述

依据不同细胞实行不同的培育细胞传代方法。悬浮生长的细胞可以用直接吹打或离心分别后传代，或自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。贴壁生长的细胞用消化法传代，局部贴壁生长的细胞用直接吹打即可传代。

细胞传代培育时常用的酶为胰蛋白酶，它可以破坏细胞与细胞、细胞与培育瓶之间的细胞连接或接触，从而使它们之间的连接减弱或完全消逝。经胰蛋白酶处理后的贴壁细胞在外力(如吹打)的作用下可以分散成单个细胞，再经稀释和接种后就可以为细胞生长供给足够的养分和空间，到达细胞传代培育的目的。

2)方法

贴壁细胞的消化法传代

①吸除或倒掉瓶内旧培育液。

②向瓶内参加适量消化液(胰蛋白酶或与EDTA混合液)，轻轻摇动培育瓶，使消化液流过全部细胞外表，然后吸掉或倒掉消化液后再加l～2mL的消化液，轻轻摇动后再倒掉大局部消化液，仅留少许进展消化。也可不承受上述步骤，直接加消化液进展消化。

③最好在37℃或25qC以上室温环境下进展消化。消化2—5min后把培育瓶放置在显微镜下进展观看，觉察细胞质回缩、细胞间隙增大后，应马上终止消化。

④吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hank”s液数毫升。轻轻转动培育瓶把残留消化液冲掉，然后再加培育液。如仅用胰蛋白酶可直接加少许含血清的培育液，终止消化。

⑤用弯头吸管，吸取瓶内培育液，反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要挨次进展，从培育瓶底部一边开头到另一边完毕，以确保全部底部都被吹到。吹打时动作要轻柔不要用力过猛,同时尽可能不要消灭泡沫，这些都会对细胞有损伤。细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。

⑥计数，分别接种在的培育瓶内。

悬浮细胞的传代

因悬浮生长细胞不贴壁，故传代时不必承受酶消化方法，而可直接传代或离心收集细胞后传代。直接传代即让悬浮细胞渐渐沉淀在瓶底后，将上清吸掉1/2-2/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后，再传代。悬浮细胞常承受离心方法传代，马上细胞连同培育液一并转移到离心管内，800～1000r/min离心5min，去除上