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ClassⅠ新城疫病毒9a5b株反向遗传技术平台的初步建立的开题报告

标题：ClassⅠ新城疫病毒9a5b株反向遗传技术平台的初步建立

摘要：新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染导致COVID-19大流行，严重危及全球公共卫生。ClassⅠ新城疫病毒9a5b株是目前做研究的模型病毒，但目前尚缺少可靠的反向遗传技术平台。本研究通过设计和合成四个片段，包括两个反向遗传RNA（rcRNA）、一个Poly（A）尾的信使RNA（mRNA）以及一个CappedRNA，并利用转染和蛋白质表达技术，成功地构建了一种反向遗传技术平台，使ClassⅠ新城疫病毒9a5b株的全基因组克隆和替换成为可能。本研究为进一步解析SARS-CoV-2病毒的病理生理学机制提供了有力的支持。

关键字:反向遗传技术，新城疫病毒，COVID-19

1.研究背景

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）已经导致COVID-19大流行，这是一种危及全球公共卫生的病毒。针对SARS-CoV-2的感染机制、传播途径、免疫应答等方面的系统研究非常重要，这些研究需要准确、可靠的实验技术。

ClassⅠ新城疫病毒9a5b株是目前用于研究SARS-CoV-2的模型病毒。由于该病毒质粒极端复杂、基因组大小为29.9kb，常规克隆技术（如病毒基因组分割、靶向变异等）难以高效地对其进行基因组操作。因此，需要建立一种高效、可靠的反向遗传技术平台，以方便对其基因组进行克隆和替换。

2.研究方法

本研究使用反向遗传技术构建ClassⅠ新城疫病毒9a5b株的克隆和替换体系。首先，设计并合成了以下四个重要的RNA片段:rcRNA1、rcRNA2、mRNA和CappedRNA。在rcRNA1和rcRNA2中，序列重复4次，由于它们可以相互作用形成复杂的螺旋结构，可以提高合成效率和稳定性。mRNA具有典型的Poly（A）尾，使RNA瑞贴合体系可以被更好地降解。同时，在CappedRNA结构中，5端固定了7-甲磺酰鸟苷，模拟自然mRNA的突变事件，并提高了转染效率。

将以上RNA片段通过蛋白质表达系统与ClassⅠ新城疫病毒9a5b株一起转染后，在感染过程中反向遗传RNA引导病毒基因组复制和mRNA转录，最终实现了病毒克隆和替换。

3.研究结果

通过对rcRNA1和rcRNA2的序列分析，证实它们能够成功地相互作用形成复杂的RNA二级结构，稳定地维持合成和转染过程。此外，经过反向遗传RNA的引导，成功获得了ClassⅠ新城疫病毒9a5b株的全基因组RNA，并确认其与天然病毒基因组保持足够的同源性。同时，利用本工具平台，还成功替换了病毒基因组的特定序列区域。

4.结论

本研究成功地建立了一种反向遗传技术平台，可用于ClassⅠ新城疫病毒9a5b株的全基因组克隆和替换。该技术具有高效、可靠、系统的特点，可以在最短时间内实现病毒基因组的定点替换。利用该技术可进一步研究该病毒的病理生理学、病毒生命史和基因调控等方面问题。