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WesternBlotting试验步骤
一，组织蛋白提取
1.准备组织细胞裂解液：1000ulRIPA+10ulPMSF,装于管中，充分混合。
注：如发现RIPA有沉淀，放室温半小时或常温水域使其溶解，若PMSF
为粉剂，将其配置成100mM液体备用。
2.组织准备：将组织从-80℃冰箱取出，放入管，用小剪刀将组织建成碎
片，用研磨杵研磨/玻璃匀浆器5ml匀浆充分。加RIPA裂解液（按每
20mg组织加裂解液150-200微升的量添加），研磨/匀浆5分钟（在冰
浴下研磨/匀浆），冰上静止30分钟。
注：1）若用玻璃匀浆器可先加3/2的裂解液，匀充分，倒到EP管，再加
剩下的裂解液，把匀浆器壁上的匀浆液充分倒出来。
3.将裂解后的样品g离心3-5分钟，取上清，分装至200ulEP管（一般有
约400ul的上清？）即可进行PAGE、Western和免疫印迹等操作。
二，提取液中总蛋白的测定
用BCA法测定，试剂盒：索莱宝BCA蛋白浓度测定试剂盒。
1.配工作液：根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu
试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时
内温度。
注：BCA工作液每个孔要加入200ul，标准曲线8个孔，
2.稀释标准品（BSA）：取10微升BSA标准品用PBS稀释至100微升（样
品一般可用PBS稀释），使终浓度为ml。将标准品按0,2,4,6,8,12,16,20
微升加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足至20ul。
3.稀释样品：最好多做几个梯度，如做2倍，4倍，8倍稀释），加稀释
好的样品20微升到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小量时的误差，
标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能让样品点落在标准线1/2以
后。
4.在各孔中加入200微升的BCA工作液，37℃放置15-30分钟。用酶标
仪测定A根据标准曲线计算出蛋白浓度。使用温箱孵育时，应注意
562nm，
防止因水分蒸发影响检测结果。
注：1）标准曲线布板：（单位：微升）
试剂/孔
12345678
编号
标准品02468121620
PBS2018161412840
工作液200200200200200200200200
样品蛋白布板：
试剂/编123456789
号
2倍稀释4倍稀释10倍稀释
样品999444222
PBS111111161616181818
工作液
200200200200200200200200200
空白对照布板：
试剂/编12345678
号
PBS2020202020202020
工作液
200200200200200200200200
注：测蛋白浓度过程中，可将剩下的蛋白样品存放于4℃。待浓度测完，可拿
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