GBT 35911-2018 伪狂犬病病毒荧光PCR检测方法.docxVIP

ICS11.220B41

中华人民共和国国家标准

GB/T35911—2018

伪狂犬病病毒荧光PCR检测方法

Real-timePCRmethodfordetectionofpseudorabiesvirus

2018-02-06发布2018-09-01实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会

发布

I

GB/T35911—2018

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。

本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中国农业科学院上海兽医研究所、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、湖南圣湘生物科技有限公司。

本标准主要起草人：张强、童光志、李健、熊炜、赵和平、李树清、王艳、李国新、杨忠苹、花群义、林颖峥、王巧全、蔡开妹、喻正军、吴绍强、林祥梅。

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GB/T35911—2018

伪狂犬病病毒荧光PCR检测方法

1范围

本标准规定了伪狂犬病病毒荧光PCR检测的操作方法。本标准适用于伪狂犬病病毒核酸检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T25172猪常温精液生产与保存技术规范

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

荧光PCR荧光聚合酶链式反应(real-timepolymerasechainreaction)

Ct值每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数(cyclethreshold)DNA脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)

Taq酶TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)TE缓冲液Tris-EDTA缓冲液(Tris-EDTAbuffer)PRV伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus)

4仪器

4.1荧光PCR检测仪。

4.2高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上。

4.3组织研磨器或者研钵。

4.4普通冰箱：2℃~8℃。

4.5普通冰柜：-20℃以下。

4.6超低温冰箱：可控温至-70℃以下。

4.7微量移液器：0.2μL~2μL、1μL~10pμL、10pL~100μL、20μL～200pμL、100μL~1000μL,并配备与移液器匹配的吸头。

4.8高压灭菌锅。

5耗材

5.11.5mL离心管。

5.20.2mLPCR薄壁管或八联管。

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GB/T35911—2018

6试剂

6.1除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682的要求。

6.2DNAzol,商品化DNA抽提试剂，于2℃~8℃保存。

6.3无水乙醇，-20℃预冷。

6.475%乙醇，无水乙醇和双蒸水配制，-20℃预冷。

6.58mmol/LNaOH溶液，配制见附录A。

6.6PBS缓冲液，配制见附录A。

6.7Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5U/μL,Taq酶反应缓冲液中Mg2+浓度为15mmol/L。

6.8dNTPs:含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10mmol/L,-20C保存，避免反复冻融。

6.9引物和TaqMan探针，其序列见附录B。

6.10伪狂犬病病毒阳性对照样品和阴性对照样品：阳性对照使用灭活疫苗或组织培养灭活毒，-20℃保存备用；阴性对照可采用健康猪的组织材料。

6.11内参照质粒：带有人β-珠蛋白基因的质粒。

7样品采集和处理

7.1采样工具

7.1.1手术刀、剪刀、镊子，经160C干热灭菌2h。

7.1.2一次性无菌采样拭子

7.1.3组织研磨器或者研钵，经160-C于热灭菌2h。

7.1.4