绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达(新手详细注释版).pdfVIP

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和

表达

背景知识

绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)是一类存在于包括水母、水螅

和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧

光。它产生荧光无需底物或辅因子。发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP由3个

外显子组成，长2.6kb；GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为

27.0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。1996年GFP的晶体结构被解

出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420nm，宽240nm，由11个围绕中

心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由

3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光

活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内

部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成.

实验一质粒DNA的分离与纯化

一、实验目的

掌握一种最常用的质粒DNA提取方法：碱裂解法。该法用

于从小量培养物中抽提质粒DNA，比较方便、省时，提取的

质粒DNA质量较高，可用于DNA的酶切、PCR甚至测序。

二、基本原理

质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。

迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链DNA分子，分子量范围从1kb到

200kb。质粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地

整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。在大多

数情况下质粒DNA复制中的酶体系和细菌染色体复制

10-200个拷贝。当宿主细胞的蛋白

时所用的酶是相同的。有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制，因此每个细胞中

只含一个或几个拷贝，称为严谨型质粒，有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严，称为

松弛型质粒，它们在每个细胞中的数目可达质合成受到抑制时（例如经氯霉素处理），

细菌染色体虽不再增加，但松弛型质粒DNA可继续被复制，以至每个细胞内的拷贝数可

以增至一千到几千。

质粒具有一定的生物功能，它们往往带有一些抗药标记，当质粒DNA用人为的方法

转化进细菌时，转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型，例如，把一

个含有抗药基因的质粒转入细菌后，原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。借助

转化菌获得的新表型特征，可证实质粒已转入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选

择性标记。

质粒作为基因克隆载体分子的重要的条件是获得批量的纯化的质粒DNA分子。目前

已有许多方法可用于质粒DNA的提取，它们都包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒

的扩增；菌体的收集裂解，质粒DNA的分离；质粒DNA的纯化。

1、细菌的生长和质粒的扩增从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗

生素的液体培养基中培养。对于松弛型质粒（如pUC系列）来说，只要将培养物放到

标准的LB或2YT培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩

增质粒DNA。但对于严谨型质粒（如pBR322）来说，则需在得到部分生长的细菌培养

物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。

2、菌体的收集、裂解和质粒DNA的分离质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般

是大肠杆菌菌株）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异：（1）大肠杆菌的染色

体较一般的载体质粒DNA大得多。（2）从细胞中提取

得

到的大肠杆菌DNA主体是变性的线性分子，而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子。

这里主要介绍碱裂解法的基本原理：在细菌悬浮液