噬菌体教学课件.pptVIP

噬菌体治疗较抗生素治疗的优势噬菌体呈指数增殖，自我复制能力大，每一个裂解周期均能产生大量子代噬菌体细菌很难对噬菌体产生耐药性噬菌体药效持续时间长准确选择相应的噬菌体也可作为预防用制剂噬菌体获取比较方便，价格比较低廉,研制开发的周期短，成本低噬菌体治疗的不足噬菌体的宿主范围有限噬菌体治疗的不足免疫源性：噬菌体作为动物体的异源物质，会刺激机体产生免疫反应，产生的抗体可能抑制噬菌体使其失去侵染敏感细菌的能力，限制其抗菌作用。噬菌体治疗的不足噬菌体可释放一些毒素编码大肠杆菌O157的毒力基因stx1和stx2可以导致发炎反应和提高致病性。噬菌体治疗的发展趋势扩大噬菌体谱改造宿主菌的裂解方式开发噬菌体抗感染药物发展趋势大多数噬菌体都是专一性的对某种细菌起作用，治疗范围受限，我们可以通过基因工程技术将多种噬菌体吸附宿主菌的关键基因转化入同一噬菌体中并使之表达，从而产生一种可以对多种细菌同时具有裂解作用的新噬菌体。噬菌体通过holin蛋白和细胞内溶素两种物质造成细菌裂解。通过对产生这两种物质的基因进行改造，改造后的噬菌体具有高效杀死细菌的能力。目前美国4家公司正试图研制针对一些重要的病原菌,如耐万古霉素肠球菌(VRE)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和食物传播的病原菌(沙门菌)的噬菌体。PhageTher-apeutics公司抗葡萄球菌制品已配制完成,其制造工艺已获FDA批准。。有的噬菌体基因组较大，可将外来目的DNA替代或插入到噬菌体基因组的某些序列中，使目的DNA随噬菌体的繁殖而大量复制和表达。第四章噬菌体载体噬菌体载体分类1噬菌体载体λ噬菌体载体P1噬菌体载体M13噬体cos载体和噬菌粒λ噬菌体颗粒中的DNA是一线性双链DNA分子，长48502bp，两端各有12个碱基的5`凸出黏性末端是互补的。进入细胞的λDNA通过两端的黏性末端环化。λ噬菌体2λ噬菌体性质与用途在λDNA分子上有多种限制性核酸内切酶识别位点，便于多种外源DNA酶切片段的克隆能承载比较大的外源DNA片段，约23kb左右用途:主要用于cDNA文库构建和外源目的基因的克隆。2λ噬菌体基因图谱3λ噬菌体载体的构建切去λDNA上部分非必需的区域和多余的限制性核酸内切酶切割位点插入可供选择的标记基因21建立λ噬菌体体外包装系统3基本策略4λDNA载体的构建缩短长度插入型载体插入位点体外包装载体长度37kb插入片段大小：0-14kb（51–37）插入片段体外包装2.2噬菌体展示技术的原理以噬菌体或噬菌粒为载体，将目标蛋白的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面，通过筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，并得到大量富集，从而获得目的多肽或蛋白质。CompanyLogoLeadHvLinkLvEPIIIPIII基因型表达型融合蛋白2.3噬菌体展示技术流程CompanyLogo2.4常用的噬菌体展示系统常用的噬菌体展示系统M13丝状噬菌体T7噬菌体T7噬菌体λ噬菌体T4噬菌体T4噬菌体2.5噬菌体展示技术的优点非展示系统展示系统2.5噬菌体展示技术的优点特定分子的基因型和其表型统一在同一个病毒颗粒内，将重组蛋白质筛选与基因筛选合二为一。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。由于丝状噬菌体易于在大肠杆菌系统中分离扩增，因此此技术又合并了选择能力和扩增能力的优势，使得噬菌体展示技术成为高效的筛选体系。操作简单易行，该技术采用经典的PCR分子克隆等技术即可操作，在几周内即可筛选106～108克隆，筛选获得抗体库可以用于原核系统表达，无需组织培养，极大地降低了成本。筛选获得噬菌体随机肽库具有容量大、体积小、筛选简便、制备成本低、可多次扩增等突出优点。2.6噬菌体展示技术的局限性所建库的容量和分子多样性受到限制；不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达；噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了