植物科学前沿-实验方法步骤western blot.pdfVIP

操作步骤

1.12%SDS电泳（上样：预染蛋白Marker5μL，蛋白样品15-20μL）

2.剪取一张与凝胶大小相似的硝酸纤维素滤膜及两张稍大于滤膜的滤纸。

3.用Western转移缓冲液将石墨块、滤纸及滤膜浸湿，将滤纸及硝酸纤维素滤膜

依次置于石墨块上，再将凝胶压在硝酸纤维素滤膜上面，盖上含有Western转移

缓冲液的滤纸，然后在它上面再盖上另一块石墨即可。

4.注意极性的正确与否，一般蛋白质的转移是从负极向正极移动的，胶靠黑板

（负极），膜靠白板（正极），60V下转移1.5-2h（转移过程中每20分钟换一次

冰）。

5.转移完毕后，将硝酸纤维素滤膜浸入40mL封闭缓冲液（2g脱脂奶粉—40

mLTBST缓冲液）中，轻轻振荡封闭1h。

6.用30mLTBST缓冲液洗膜5次，每次5分钟。并不时轻轻振荡。

7.将膜浸入用25mL含1%100BSA的1*TBST缓冲液稀释的第一抗体中

（12.5μL—25mL），室温下轻轻振荡反应至少1h（稀释倍数可根据不同抗体自

己确定）。

8.再用30mLTBST缓冲液洗膜3-5次，每次5分钟，并不时轻轻振荡。

9.将硝酸纤维素滤膜浸入25mL含1%100BSA的1*TBST缓冲液稀释的第二抗

体中（3.75μL—25mL），轻轻振荡，室温下反应1h。

10.用30mLTBST缓冲液洗膜6次，每次5分钟。并不时轻轻振荡。

方法一：显色法

1a.现配显色底物。在30mL显色缓冲液中先后加入NBT198μL和BCIP99μL。

1b.将硝酸纤维素滤膜浸入显色缓冲液中，避光显色15-20min，并需不时轻轻振

荡，直至阳性反应清晰显示为止。显色后取出置于清水中。

方法二：化学发光法

将硝酸纤维素膜平放在胶片上，滴加1ml的发光底物（EnhancedLuminolReagent

和OxidizingReagent等体积混合），压盖胶片，在Blast300化学发光成像系统

（211平台）下拍照。

附试剂：

1.Western转移缓冲液(pH8.3)：2L

Tris·Cl48mmol/L11.63g

甲醇20%400mL

甘氨酸39mmol/L5.86g

SDS0.037%0.74g

2.显色缓冲液(pH9.5)：200mL

Tris·Cl100mmol/L2.423g

NaCl100mmol/L1.169g

MgCl25mm