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ModernInstrumentAnalyticalMethod§12.1分子发光的基本原理v第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，1575年他提到在含有一种称Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色。v直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。v1867年，Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。v19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一台荧光计。

ModernInstrumentAnalyticalMethod一.分子荧光与磷光的产生1.单重态与三重态2.分子的活化与去活化光致发光3.分子发光的类型化学发光/生物发光热致发光场致发光按激发的模式分类：分子发光摩擦发光按分子激发态的类型分类：瞬时荧光荧光迟滞荧光磷光分子发光按光子能量分类：斯托克斯荧光(Stokes)：λexλem荧光反斯托克斯荧光(Antistokes)：λλemex共振荧光(Resonance)：λex=λem

ModernInstrumentAnalyticalMethod分子的活化与去活化１.辐射跃迁的类型共振荧光：10-12sec荧光：10-8sec磷光：1~10-4sec反系间窜跃内转移振动弛豫荧光S2系间窜跃紫迟滞荧光:10~10-4sec2外可见吸收光谱S1２.无辐射跃迁的类型振动弛豫:V10-12secrT1外转移:无辐射跃迁回到基态迟滞荧光紫外可见共振荧光S光谱内转移:S~S能级磷光21之间有重叠系间窜跃:S~T能级21之间有重叠反系间窜跃:由外部获取能量后T01~S2外转移

ModernInstrumentAnalyticalMethod二.分子荧光(磷光)光谱1.荧光(磷光)激发光谱与发射光谱荧光(磷光)均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不同波长的荧光。固定?=620nm(MAX)emA.激发光谱固定发射波长扫描激发波长?ex=290nm(MAX)荧光激发光谱与紫外-可见吸收光谱类似

ModernInstrumentAnalyticalMethodB.发射光谱(荧光光谱)固定激发波长扫描发射波长发射光谱的形状与激发波长无关：分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即使分子被激发到高于S的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到1S电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。1C.激发光谱与发射光谱的镜像关系固定?=620nm(MAX)固定?=290nm(MAX)emex1→41→11→21→41→31→243S1211→41→14321S0?=290nm(MAX)?em=620nm(MAX)ex

ModernInstrumentAnalyticalMethod与发射光谱相同条件下的磷光光谱D.磷光光谱激发光谱发射光谱

2.三维荧光光谱I∝f(λ、λ)Fexem固定发射波长、扫描激发波长蒽的激发光谱

I∝f(λ、λ)Fexem固定激发波长、扫描发射波长蒽的发射光谱

蒽的三维等高线光谱图

蒽的三维等荧光强度光谱

ModernInstrumentAnalyticalMethodVB和VB的三维荧光光谱12

3.三维共振光散射光谱TS散射片三维共振光散射光谱散射片三维共振光散射等高线光谱图ex二级共振光散射三级共振光散射

ModernInstrumentAnalyticalMethod三.分子荧光(磷光)强度与荧光物质浓度的关系1.荧光强度(磷光)与浓度的关系光吸收定律（Lambert–BeerLaw）相应的吸光分数为：荧光强度（I）与相应的吸光分数成正比：F按照级数展开式：

ModernInstrumentAnalyticalMethod对于稀溶液，当?bc0.05（磷光?bc0.01）时：IF----荧光强度IP----磷光强度?F-----荧光量子产率?P-----磷光量子产率b--吸收光程k--与仪器灵敏度有关的参数I0--入射光强度。?--摩尔吸光系数C--荧光物质浓度2.荧光(磷光)的平均寿命分子在激发态的平均时间或者说处于激发态的分子数目衰减到原来