DB34T 2562-2015 大曲酯酶活力的检测 酶联免疫法(ELISA).docxVIP

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DB34

安徽省地方标准

DB34/T2562—2015

大曲酯酶活力的检测酶联免疫法(ELISA)

DeterminationofesteraseactivityinDaqu—Enzyme-linkedimmunosorbentassay

(ELISA)

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2015-12-30发布2016-01-30实施安徽省质量技术监督局发布

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DB34/T2562—2015

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由安徽省浓香型白酒标准化技术委员会提出并归口。

本标准起草单位：安徽瑞思威尔科技有限公司、安徽古井贡酒股份有限公司、安徽农业大学。

本标准主要起草人：周庆伍、李安军、蒋军、汤有宏、江昌俊、梁绍勋、李晓欢、何宏魁、吴文睿、刘国英、汪君、李红歌、马侠。

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DB34/T2562—2015

大曲酯酶活力的检测酶联免疫法(ELISA)

1范围

本标准规定了大曲酯酶活力的检测酶联免疫法。本标准适用于大曲酯酶活力的测定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

酯酶活力单位esteraseactivityunit

在37℃、pH6.0条件下，15min水解α-乙酸萘酯转化为α-萘酚，每产生1nmolα-萘酚为1

个酯酶活力单位(U)。

4原理

HYPERLINK试样中的酯酶与微孔中包被的羧酸酯酶抗体结合，在酶标记物的作用下，形成的酶标抗体抗原复合物与显色剂发生反应，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中酯酶活力。

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5试剂和材料

5.1本实验所用试剂除非另有说明，均为分析纯，水为符合GB/T6682二级水。

5.2酯酶试剂盒：2～8℃冰箱中保存。

注：不同品牌的酯酶试剂盒其操作步骤可能有所不同，溶液配制和测试程序等可根据其试剂盒使用说明书略作调整。

5.2.1包被羧酸酯酶抗体的聚苯乙烯微量反应板。

5.2.2羧酸酯酶标准品：450U/L。

5.2.3羧酸酯酶标记物。

5.2.4羧酸酯酶标准品稀释液。

5.2.5试样稀释液。

5.2.6洗板母液。

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5.2.7显色剂A。

5.2.8显色剂B。

5.2.9反应终止液。

5.3磷酸二氢钠(NaH?PO4·2H?O):优级纯。

5.4磷酸氢二钠(Na?HPO4·12H?O):优级纯。

5.5氯化钠(NaCl):优级纯。

5.6磷酸盐缓冲溶液：pH=7.4。分别称取0.62g磷酸二氢钠(5.3)、5.73g磷酸氢二钠(5.4)和9g氯化钠(5.5),加水溶解至1000mL,在pH计上调节溶液pH=7.4。

5.7羧酸酯酶标准溶液：根据酯酶试剂盒(5.2)的线性范围，用羧酸酯酶标准品稀释液(5.2.4)将羧酸酯酶标准品(5.2.2)稀释成不同活力的标准工作溶液，每次测定现配现用。

5.8洗涤液：将洗板母液(5.2.6)按照酯酶活力试剂盒中规定的比例用水稀释，混匀后备用。

6仪器和设备

6.1酶标仪(配备450nm滤光片)。

6.2分析天平：感量1mg

6.3冷冻离心机。

6.4振荡器。

6.5恒温培养箱。

6.6超声波细胞破碎仪。

6.7pH计。

7测定步骤

7.1粗酶液制备

7.1.1称取0.1～0.5g试样，精确到0.001g,置于100mL烧杯中，加50mL磷酸盐缓冲溶液(5.6),振荡10min。将烧杯置于超声波细胞破碎仪(6.6)中，超声探头直径6～8mm、超声温度4～8℃、超声时间3～5s、间歇时间3～5s、超声功率300～350W、总超声时间5～10min,制成试样液。

7.1.2试样液于4～8℃、5000r/min离心10min,取1mL上清液于2