细胞培养操作规范.ppt

关于细胞培养操作规范一：细胞培养的基本条件：1.无菌环境：细胞培养间消毒a：使用前紫外照射20-30分钟b：使用完75%酒精擦拭台面，紫外照射15分钟。c：每两周用84消毒液擦拭地面、台面一次的方式进行消毒第2页,共27页，星期六，2024年，5月超净工作台：使用前开启柜内紫外灯照射15－30分钟使用时开启鼓风，在台面内操作使用完毕后要用75%酒精将台面和台内四周擦拭干净，紫外照射10分钟。第3页,共27页，星期六，2024年，5月CO2培养箱：1.设定的条件为37℃，5％CO2。2.使用CO2培养箱应注意的问题：?用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。?保持培养箱内空气干净，定期消毒擦拭。?箱内蒸馏水槽中定期更换灭菌蒸馏水3000毫升，以保持箱内湿度。第4页,共27页，星期六，2024年，5月控制水盘内污染的方法：?1、?定期(至少每两周一次)，更换水盘内的无菌蒸馏水或无菌去离子水。2、?在水盘内添加适量硫酸铜，预防真菌污染。配制方法：20g无水硫酸铜＋5ml浓硫酸＋1L灭菌纯水。3、?水盘内添加适量抗生素。?4、定期为培养箱（含水盘）进行一次高温灭菌。第5页,共27页，星期六，2024年，5月2.细胞培养条件细胞培养器皿：细胞培养瓶：?25平方厘米（加液量3-5ml）?75平方厘米（加液量10-15ml）?150平方厘米（加液量40ml）细胞培养板：第6页,共27页，星期六，2024年，5月细胞培养皿?35mm（加液量3ml)?60mm（加液量5ml)?100mm（加液量10ml)150mm(加液量15ml)第7页,共27页，星期六，2024年，5月常用培养基：RPMI1640：适合许多种细胞，如肿瘤细胞、正常细胞的原代培养、传代培养等。尤其适合人白细胞，如H9、HL-60、IM-9和K-562等细胞系的培养。DMEM：DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高压灭菌】DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型（4500mg/L）、除菌过滤灭菌】DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型(1000mg/L)、除菌过滤灭菌】第8页,共27页，星期六，2024年，5月血清：常用血清种类：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清血清的灭活（消除补体活性）56℃，30分钟。使用浓度：5%-20%，一般10%血清的消毒：过滤除菌血清解冻步骤：–20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般用15ml无菌离心管分装。第9页,共27页，星期六，2024年，5月谷氨酰胺：谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃保存，临用前加入培养液。第10页,共27页，星期六，2024年，5月消化液：胰蛋白酶溶液：常用浓度：0.25%。消化时间：2-10分钟（显微镜下观察）用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。第11页,共27页，星期六，2024年，5月EDTA溶液使用浓度：?0.02%，与胰蛋白酶配合使用。?EDTA不能被血清中和，终止消化后，需用培养液或PBS彻底冲洗培养瓶。第12页,共27页，星期六，2024年，5月二：细胞培养前准备工作：1.相关耗材：细胞培养皿（瓶）若干、离心管（15ml,50ml）、100ml玻璃瓶4个、500ml玻璃瓶4个、2mL冻存管、tip头及枪头盒、吸管（10ml刻度）、吹打管、50ml、10ml、5ml注射器、一次性针孔过滤器（0.22um）、一次性口罩、帽子、手套、纱布、牛皮纸、标签纸第13页,共27页，星期六，2024年，5月2.相关试剂及配制方法：细胞培养的相关试剂配制均在超净工作台上操作，严格按照无菌操作流程！完全培养基:基础培养基90%血清10％碳酸氢钠2.0g/L青、链霉素100U／ml过滤除菌4℃保存使用时加入谷氨酰胺（配制方法：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。第14页,共27页，星期六，2024年，5月胰蛋白酶-EDTA消化液称取0.25g的胰蛋白酶和0.02g的EDTA用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液或D-Hank’s配制，用滤器过滤除菌，-20℃分装保存。细胞冻存液配制：90%血清和10%DMSO第15页,共27页，星期六，2024年，5月3：常用培养器皿的清洗及消毒玻璃器皿的清洗刷洗（自来水）、浸泡（洗衣粉）、