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非洲猪瘟病毒等温扩增快速检测方法

1范围

本标准规定了非洲猪瘟病毒等温扩增快速检测方法的技术要求。

本标准适用于非洲猪瘟疫病的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪血液、脾脏、淋巴结、肾脏等组织样品中非洲猪瘟病毒核酸的快速检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

3原理

非洲猪瘟病毒是一种DNA病毒，该检测方法利用6条特异性引物和具有链置换能力的DNA聚合酶，在等温环境下1h内完成扩增，用于非洲猪瘟病毒的核酸检测。

4仪器和器材

4.1高速台式冷冻离心机（离心范围0～20000r/min）

4.2冰箱：4℃±1℃冰箱，-20℃±1℃冰箱，-7℃±1℃冰箱

4.3恒温LAMP扩增仪（型号：Gene-8C）

4.4离心管：15ml离心管、1.5ml离心管和0.2mlPCR专用离心管

4.5微量移液器：1000μl，200μl，100μl，50μl，20μl，10μl，2μl

5试剂和引物

5.1样品处理剂

5.2ASFV-R-Mix

5.3Bstenzyme

5.4D-I矿物油

5.5阳性对照

5.6阴性对照

注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所有实验使用的试剂等级均为不含DNA或DNase的分析纯或生化试剂；所有试剂均用无菌的容器分装。

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6操作步骤

6.1样品的采集、前处理、存放与运输

6.1.1采样注意事项

采集样品及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。

6.1.2采样工具

15ml离心管和1.5ml离心管经121±1℃高压灭菌20min；剪刀、镊子经160℃干热灭菌2h，无菌管（真空采血管）。

6.1.3组织病料的采集与前处理

采集疑似非洲猪瘟病毒感染猪的肺脏、肝脏、肾脏、脾脏等组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品约10g于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，加入0.3ml～0.5ml组织悬液混匀，60℃,30min灭活后，将悬液转入无菌Eppendorf管中，4℃条件下5000r/min离心10min，编号备用。

6.1.4全血及血清样本的采集与前处理

使用含有抗凝血剂（EDTA-紫色盖）的无菌管（真空采血管）从耳静脉或前腔静脉采集血液3ml～5ml，60℃,30min灭活后，可直接检测；若检测血清，可静置全血样本待血清析出后，直接吸取至无菌Eppendorf管中，60℃,30min灭活后，编号备用。

6.1.5存放与运输

采集或处理的样品在2～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在8h之内运送到实验室检测。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。

6.2样品DNA的提取

取10μl前处理过的样本加入无菌1.5ml离心管，加入10μl样品处理剂，混匀，94℃裂解2min，瞬时离心，上清即为扩增模板。

6.3核酸扩增

6.3.1吸取22μlASFV-R-Mix和1μlBstenzyme加入同一个PCR管，吸取2μl步骤6.2处理的

核酸扩增模板加至PCR管，混匀，设置阴阳性对照；

6.3.2吸取10μlD-I矿物油轻轻加至PCR管液面，切勿震荡混匀；

6.3.3插入到恒温扩增仪反应槽中；

6.3.4设置恒温扩增仪器反应条件为：65℃反应12min，荧光采集周期20s。

7试验成立条件与结果判定

7.1试验成立条件

使用前用阴、阳性对照进行该检测方法评价，若阳性对照CT值≤40，阴性对照CT值＞40，则检测结果有效。

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7.2结果判定

若CT值≤40，样品应判定为非洲猪瘟病毒核酸阳性；若CT值＞40，样品应判定为非洲猪瘟病毒核酸阴性

8实验室生物安全要求

按照GB19489实验室生物安全通用要求执行。

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附录A

（规范性附录）

试剂配制

A.1样品处理剂的制备

量取80mlPBS（0.01mol/L，pH值7.4），加入10μlNP40（乙基苯基聚乙二醇），无菌纯化水定容至