细胞生物学研究方法.ppt

线虫的基因组于1998年测序完成，是人类得到的第一个动物物种的基因组,共有109个碱基对，约含18400个基因。第92页,共95页，星期六，2024年，5月果蝇的基因组于2000年测序完成，共有1.4×109个碱基对，约含13600个基因。第93页,共95页，星期六，2024年，5月小鼠的基因组测序工作预计到2007年完成，推测其基因组共有3.3×1010个碱基对，约含40000个基因。第94页,共95页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第95页,共95页，星期六，2024年，5月**DNA特异性的显示方法Feulgen反应：利用酸水解去除细胞中的RNA，仅保留DNA，并且除去DNA嘌呤脱氧核糖核酸的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露，所暴露出的自由醛基与希夫试剂反应呈紫红色。第60页,共95页，星期六，2024年，5月第61页,共95页，星期六，2024年，5月多糖的显示方法PAS（过碘酸希夫氏）反应利用过碘酸的强氧化作用破坏糖分子的C-C键，使糖分子氧化产生双醛基，自由的醛基与希夫试剂作用形成紫红色产物。第62页,共95页，星期六，2024年，5月脂类物质的显示方法对脂类物质的染色应用的是物理的扩散原理。苏丹类染料是脂溶性染剂，它溶于酒精但更易溶于脂肪，所以当含有脂肪的标本与苏丹染料接触时，它会脱离酒精而溶于脂类结构中从而显色。第63页,共95页，星期六，2024年，5月细胞中各种酶的显示方法由于酶易受外界条件影响而变性失活。对酶的显示一般采取间接的方法进行，对可以与酶发生特异性结合的底物进行染色从而达到显示酶的目的。在实验的过程中需在尽量保持酶的活性。第64页,共95页，星期六，2024年，5月三、特异蛋白抗原的定位与定性?免疫荧光技术： 快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限?免疫电镜技术：?免疫胶体金技术应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等。第65页,共95页，星期六，2024年，5月细胞内对于蛋白质分子的定位技术包括免疫荧光、免疫印迹以及免疫电镜等，这些技术都是基于免疫学中抗原抗体特异性反应的原理而设计的。将抗体分子上加上不同的可供识别的标记，从而显示出某种蛋白质在细胞内的分布和定位。抗原抗原抗体特异性结合免疫荧光标记免疫酶标记第66页,共95页，星期六，2024年，5月免疫荧光技术第67页,共95页，星期六，2024年，5月第68页,共95页，星期六，2024年，5月免疫电镜技术第69页,共95页，星期六，2024年，5月四、细胞内特异核酸的定位与定性 ?光镜水平的原位杂交技术（同位素标记或荧光素标记的探针） ?电镜水平的原位杂交技术（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）?PCR技术第70页,共95页，星期六，2024年，5月五、放射自显影技术?原理及应用：?利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；?实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。?步骤：?前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记）———放射自显影第71页,共95页，星期六，2024年，5月放射自显影第72页,共95页，星期六，2024年，5月六、定量细胞化学分析技术细胞显微分光光度测定术利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 包括：紫外光显微分光光度测定法；可见光显微分光光度测定法流式细胞仪（FlowCytometry）主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离DNA含量不同的中期染色体。第73页,共95页，星期六，2024年，5月流式细胞仪第74页,共95页，星期六，2024年，5月第三节

细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、细胞培养细胞培养是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。近年来细胞生物学一系列主要理沦研究的进展，如细胞全能性的揭示，细胞周期及其调控。癌变机制与细胞衰老，基因表达与调控，细胞融合以及一些细胞工程技术的建立都是与细胞培养技术分不开的。第75页,共95页，星期六，2024年，5月1、动物细胞培养?类型：原代培养细胞；继代培养细胞细胞株（cellstrain）正常二倍体，接触抑制细胞系（cellline）亚二倍体，接触抑制丧失2、植物细胞?类型：原生质体培养