免疫学检验技术—免疫组织化学检验技术.pptx

知识目标

1.掌握：免疫组化技术的定义、基本过程、抗原的修复方法（重难点），抗体的选择和保存；酶标记抗体的免疫组化染色（直接、间接法）的原理，荧光免疫组化标本类型和保存。

2.熟悉：免疫组化标本来源、固定于保存，结果判断；非标记酶免疫组化的常见类型及原理、亲和组织化学技术的定义及分类（重点）。

3.了解：常见亲和组织化学技术的原理、优缺点及应用。

能力目标

掌握抗原的修复方法，免疫组化标本的采集、固定于保存、结果判断。

思政-素质目标

责任心、质控、生物安全意识、临床免疫学思维

;目录;免疫组织化学检验技术又称免疫细胞化学检验技术

---是利用标记的特异性抗体（或抗原）与组织细胞内抗原（或抗体）进行的抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对组织和细胞抗原进行定性、定位、定量测定的免疫检测方法。;免疫组化的检测原理;免疫组化的检测原理;免疫组化的检测原理;免疫组化全过程;第一节

免疫组化检验技术基本知识;一、标本制作;（二）标本的固定与保存

1．组织材料的固定目的

①防止组织细胞的死后变化，以保持其固有形态

②使细胞内的蛋白质等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构

③使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，以便染色后易于鉴别和观察

④固定剂兼有硬化作用，使组织硬化，便于制片

⑤防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构

⑥经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。;2．固定剂的选择

最佳固定剂的标准

①最好地保持细胞和组织的形态结构

②最大限度地保存抗原的免疫活性

3．固定方法

固定方法常用

①浸泡法—主要适用于活检和手术标本以及其它不能进行灌注的组织固定。

②灌注法—适用于动物实验研究。;（三）玻片的处理

玻片的处理是做好免疫组化染色的重要步骤之一

一般用免疫组织化学的载玻片均需涂一定的黏合剂，常用的切片黏合剂有树脂胶、多聚赖氨酸和防脱片剂

（四）切片方法的选择;二、抗原处理;（三）热诱导的抗原修复

抗原修??是以高温、高压对常规固定石蜡切片进行抗原修复以提高抗原抗体的阳性检出率

微波处理法

水浴锅法

压力锅法

;三、抗体处理;四、常用标记物;五、免疫组织化学技术的结果判断;3.阴性试剂对照

是指用于证实在免疫组化染色中所用试剂（尤其是特异性抗体试剂的有效性和可靠性）而设立的同步免疫染色对照，包括有：空白对照、替代对照、吸收试验和抑制试验等。

4.自身对照

是指在同一标记切片上的自身组织成分的阴性背景对照。;（二）阳性结果

阳性细胞的显色可位于细胞膜、细胞质和细胞核

免疫显色强度和阳性细胞密度是定性、定量指标

阳性细胞的着色形态（如胞膜型、胞核型、胞质(浆)型等）及组织分布特点（如局灶型、弥漫型、片块型等）主要是定位指标

哪怕只有少数细胞阳性（只要是抗原所在部位）也应视为阳性表达;（三）阴性结果

阴性结果不能简单视为抗原不表达，由于染色方法灵敏度有高低之分，有时可因灵敏度不够，而导致阴性反应。

（四）特异性显色和非特异性显色的鉴别

1.分布位置

特异性反应必须分布于特定抗原部位

非特异性反应无一定的分布规律;2.显色强度

特异性反应由于细胞内抗原含量不同，显色强度不一。阳性细胞的染色常定位于细胞，并与阴性细胞间有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，常为成片的细胞。

3.其他

在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性显色。;六、质量控制;第二节酶免组织化学检验技术;一、标本制作;二、酶标记抗体的免疫组化染色法;（二）技术类型

1.直接法

形成抗原一抗体一酶复合物

2.间接法

形成Ag-Ab1-Ab2﹡E复合物

3.酶标抗体三步染色法为间接法的改良法

形成Ag-Ab1-Ab2﹡E-Ab3﹡E复合物

（三）方法评价;三、非标记抗体酶免疫组化染色法;（二）技术类型

1.酶桥法

用辣根过氧化物酶（HRP）免疫动物（如兔）制备抗HRP的抗体（Ab3），经Ab2（如羊抗兔）作桥，将结合在组织抗原上的Ab1(兔抗相应组织抗原的抗体)与Ab3连接起来，最后将HRP与Ab3结合形成Ag-Ab1-Ab2-Ab3-HRP复合物，加底物显色;;2.PAP法

即过氧化物酶（P）-抗过氧化物酶（AP）法，为酶桥法的改良，技术要点基本上与酶桥法相同，但该法将抗酶抗体（抗过氧化物酶（AP））与酶（过氧化物酶（P））制成了可溶性复合物（PAP）,该复合