荧光免疫技术（免疫学检验技术课件）.pptx

荧光免疫技术;免疫荧光技术

免疫荧光分析(Immunofluorescenceassay，IFA)始创于40年代初，是免疫标记技术中最早的检测方法。1942年Coons等多次报道用异硫氰酸荧光素标记抗体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原，当时由于此种荧光素标记物的性能较差，未能推广使用。

直至50年代末期，Riggs等(1958)合成性能较为优良的异硫氰酸荧光素。Mashall等(1958)对荧光抗体的标记方法又进行改进，从而使免疫荧光技术逐渐推广应用。

;用荧光素标记Ab或Ag，与待测标Ag或Ab结合，通过检测荧光，确定标本中有无相应的Ab或Ag。

;荧光抗

体技术;第一节基本知识;荧光效率：荧光物质将吸收的光能转变成荧光的百分率。;荧光寿命：

指荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同。

荧光的淬灭：

荧光物质在某些理化因素或受到激发光较长时间的照射作用，会发生发射荧光减弱甚至消退的现象。如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等。;Stokes位移

荧光物质从激发态回到基态的过程中，由于部分能量丢失而导致发射光波长比激发光波长，两者波长之差。

荧光偏振

荧光物质经单一平面的偏振光照射后，吸收光能并发出单一平面的偏振荧光的现象。;荧光素

能吸收激发光的光能产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物，亦称荧光色素。

每一种荧光素有特定的激发光（吸收），发射出固定波长的荧光，荧光有红，橙，黄，绿，青，蓝，紫；但常用的有绿，红和蓝。;常用的荧光素主要有：

异硫氰酸荧光素(FITC)，最大吸收光谱为490~495nm，最大发射光谱为520~530nm，呈黄绿色荧光。

四乙基罗丹明(RB200)，最大吸收光谱为570nm，最大发射光谱为595~600nm，呈明亮橙色荧光。

四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)，最大吸收光谱为550nm，最大发射光谱为620nm，呈橙红色荧光。;荧光物质;

荧光物质;FITC;（二）影响荧光的因素;三、荧光抗体的制备;;(1)去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤;

(2)去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法;

(3)去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收。;荧光素与蛋白结合率、抗体效价、抗体特异性、抗体抗体特异性染色滴度。;第二节荧光免疫显微技术;以荧光显微镜为检测工具，用荧光素标记抗体或抗抗体，检测组织切片中的细胞抗原或血清中的抗体，观察特异性荧光，用于样本的定性和定位检查。;组织切片中的荧光;（一）直接法;;滴加荧光抗体于待检标本片上，经反应和洗涤后在荧光显微镜下观察。标本中如有相应抗原存在，即与荧光抗体特异结合，在镜下可见有荧光的抗原抗体复合物。此法的优点是简单、特异。

但其缺点是检查每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体，且敏感性低于间接法。

;（二）间接法;（1）抗原间接定位法;（2）抗体间接定位法;;间接法：此法的优点是敏感性高于直接法，而且无需制备多种荧光素标记的抗体，就可用于检测同种动物的多种抗原抗体系统。间接法有时易产生非特异性荧光（特异性低），为其缺点。;用两种荧光素分别标记两种不同的特异性抗体，对同一标本进行荧光染色，洗涤后在荧光显微镜下用两种不同的激发光激发，若有两种抗原存在，可显示两种颜色的荧光。

;;（1）直接法;抗甲抗原抗体;;Actin免疫荧光染色（cy3标记）;三、关键技术;一、标本的制作;（二）荧光抗体染色

于已固定的标本上滴加经相关试剂（含适当稀释的荧光抗体），置湿盒内25℃～37℃温育30分钟左右或4℃过夜；然后用PBS充分洗涤，待干燥后镜检。

;（三）荧光显微镜检查

;荧光显微技术特点;光源－汞灯;光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯

滤光片：隔热、激发和吸收滤光片

光路：透射光、落射光

聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器

镜头：消色差镜头;隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。

激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长的光域，提供合适的激发光。

吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过，保护眼睛。;透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。

落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。;阳性细胞显色有均质型、核膜型、斑点型核仁型，显色深浅可作为抗原