免疫细胞及其功能检验技术（免疫学检验技术课件）.pptx

免疫细胞及其功能检验技术;免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞，主要包括淋巴细胞、单核-巨噬细胞、树突状细胞、各种粒细胞、红细胞和肥大细胞等。

;临床上如出现感染、自身免疫病、免疫缺陷症、肿瘤等疾病以及移植后的免疫抑制状态时，均可出现不同免疫细胞或其亚群的数量和功能的变化。;目录;第一节免疫细胞的分离与纯化;;（一）自然沉降法;（一）自然沉降法;某些高分子聚合物如明胶、右旋糖酐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等可使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之更易与白细胞分离。

;（二）高分子聚合物沉降法;外周血单个核细胞(PBMC)主要指淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验中最常用的细胞群，也是进行T细胞和B细胞分离纯化的重要环节。;人外周血中各类血细胞密度;;Ficoll分离液法：密度1.077±0.001，主要用于分离外周血??的单个核细胞。

原理：

Ficoll分层液：2份6%聚蔗糖（ficoll)水溶液+1份34%泛影葡胺（hypaque)生理盐水溶液。

离心：密度梯度离心

分离：各类细胞按其相应密度重新分布。

分离纯度可达95%，细胞获取率80%。试验尽量在低温下进行（4℃~8℃或冰浴）。;注意：温度以20℃最适宜，超过25℃影响细胞得率;Ficoll分层液分离单个核细胞示意图;（二）Percoll分层液法;78％;三、淋巴细胞的纯化及亚群的分离;﹡红细胞的去除：一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。

﹡血小板的去除：将PBMC悬液通过离心洗涤2～3次，常可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。

在某些疾病状态下，若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度离心法去除PBMC中混杂的血小板。;﹡单核细胞的去除：黏附法

羰基铁吞噬法（磁铁吸引法）

苯丙氨酸甲酯去除法

;2．羰基铁粉吞噬法

单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大，再经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心后，则单核细胞沉积于管底而被去除。也可在单核细胞悬液内加入羰基铁粉颗粒，待单核细胞充分吞噬羰基铁粉后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中即含较纯的淋巴细胞。;3．苯丙氨酸甲酯去除法

苯丙氨酸甲酯(PME)具有亲溶酶体性质，能渗入细胞溶酶体内被水解为游离氨基酸，导致溶酶体内因渗透压改变而破裂，释放出的酶类物质可引起细胞溶解。用该法可溶解含溶酶体的细胞，如单核细胞、粒细胞和成纤维母细胞等，B细胞和大多数T细胞因缺乏溶酶体酶，因而不受影响。该法去除单核细胞后，约99%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。;E花环降法

尼龙棉分离法

免疫磁珠分离法

;T细胞

（CD2/LFA2/E受体）;E花环沉降法;E花环沉降法;2.尼龙棉柱分离法;原理

将针对淋巴细胞特殊表面标志的某种特异性单克隆抗体与磁珠结合形成免疫磁珠（IMB），当特异性单克隆抗体与表达相应抗原的靶细胞结合，利用磁场可以将IMB所结合细胞与其他细胞分离。包被磁珠的抗体可以是第一抗体或第二抗体。;免疫磁珠分离法;;;;;﹡大吞噬细胞:即单核-吞噬细胞系统

﹡小吞噬细胞:即中性粒细胞（抗细菌感染）;1.特征性标志:CD14

2.分离技术:

Pecoll密度梯度分离法

流式细胞仪分离技术

免疫磁珠分离法：为目前较常用的方法

黏附法;用Percoll分层液法或粘附去除法可获取人外周血单核细胞，但所获得的细胞数量较少。

用流式细胞仪可自动化地对单个细胞进行多参数定量测定分析，从而可分选出用特异性荧光抗体标记的阳性细胞。其优点是分离细胞准确、快速，纯度达90%～100%，回收率高，所分离的细胞可保持无菌，细胞结构和生物学活性不受影响。缺点是费用昂贵，拟分离的细胞在混合群体中含量过低时，耗时较长才能获得所需数量细胞。

;免疫磁珠分离法;免疫磁珠分离法;☆斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞

用斑蟊敷贴法可从人体组织渗出液中获取巨噬细胞。用斑蟊乙醇浸液刺激前臂内侧皮肤，诱发无菌性皮炎，从皮泡渗出液中可获取来自皮下组织中的巨噬细胞。该法获取的巨噬细胞数量较多且纯度较高，但对皮肤有一定损伤，有时可引起局部感染，应慎用。

☆动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取;血中红细胞和白细胞的比例约为600～1000:1，两

类细胞密度不同，其沉降速度各异，通常用以下两种方

法分离:;第二节淋巴细胞数量及功能检测;淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验