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肠炎沙门菌spiC基因原位回补株的构建及其生物学特性的研究

摘要：沙门菌是一种重要的人兽共患病原菌，对畜禽养殖业和人类健康安全造成严重危害。SpiC是沙门菌毒力岛2编码的效应蛋白，介导沙门菌SPI2主要毒力。本实验利用同源重组的原理构建肠炎沙门菌C50041的spiC基因原位回补菌株，鉴定正确后，将其与野生株和spiC缺失株进行生物学特性的对比分析。研究结果表明，与野生株相比，C50041ΔspiC在巨噬细胞内增殖能力显著强于野生株，对小鼠毒力显著下降。而C50041ΔspiC::spiC的生物学特性和毒力与野生株无显著差别。对SpiC功能的研究可能为肠炎沙门菌的防控提供新的思路，为疫苗和新型药物提供潜在靶标。同时，沙门菌spiC基因原位回补株的研究进一步验证了spiC基因的功能。

关键词：肠炎沙门菌C50041，spiC基因，原位回补株

1引言

1.1沙门菌

肠炎沙门菌是一种革兰阴性、需氧兼性厌氧菌，是最重要的人畜共患病原体之一。沙门菌的入侵和在宿主细胞内复制会导致一系列疾病，包括肠胃炎，菌血症，肠热和局灶性感染。我国每年由沙门菌引起的肠胃炎病例为987万例，有时会发生由沙门菌感染引起的暴发事件。在沙门菌感染过程中，畜禽和带菌者是主要感染源，蛋类、家禽和肉制品是主要传播媒介。患者和动物体内长期携带和排出细菌，会造成环境污染和沙门菌的反复污染，在条件适宜的情况下，导致疾病再次发生和流行[3]。更严重的是，作为兼性细胞内病原体，肠炎沙门菌可侵入并在吞噬细胞和非吞噬细胞存活，这限制了无法渗透到细胞中的传统抗生素（例如氯霉素，氨苄青霉素）的治疗效率。适应宿主的肠炎沙门氏菌菌株会引起全身感染，并且能够长时间系统性地持续存在，并引起重大的公共卫生问题。

1.2沙门菌的致病机理

沙门菌属肠杆菌科，是一种重要的食源性人畜共患病原体，每年感染数百万人和牲畜，甚至导致人畜死亡，造成严重的经济损失。

沙门菌被摄入后进入肠道，侵入肠上皮细胞和树突状细胞。随后，沙门菌使用T3SS1的非侵入性主动入侵，使用菌毛或细菌表面上的其他粘附素进行入侵。（1）沙门菌保留在被称为包含沙门菌的液泡（SCV）的修饰吞噬体中，并将有限数量的效应蛋白，例如SipA，SipC，SopB/SigD，SodC-1，SopE2和SptP注入细胞质。（2）在SCV中进行复制。沙门菌能够在SCV中存活并复制，从而能够避免宿主抗微生物效应子机制。（3）沙门菌运输，M细胞穿透后，入侵的微生物易位至肠淋巴滤泡和引流性肠系膜淋巴结，其中一些会传至肝和脾的网状内皮细胞[5]。

细胞内生存要求细菌识别和抵抗先天免疫系统的组成部分，包括阳离子抗菌肽和吞噬液泡的酸性pH。沙门氏菌对宿主固有免疫力的识别导致对细菌细胞表面重塑以促进细胞内存活重要的基因转录激活。胞内环境和随后的细菌膜重塑的感测依赖于调节蛋白。沙门菌的发病机制也高度依赖于上编码两个不同的III型分泌系统（T3SSs）沙门氏菌致病岛（SPI）1和2，其功能运输效应蛋白对宿主细胞的细胞质。这些效应靶宿主细胞的过程，推动沙门菌侵入和在细胞内生存。在与宿主细胞接触时，沙门菌SPI-1T3SS输送蛋白质穿过质膜，以使细菌侵入，并且诱导肠炎症反应。SPI-2T3SS转运的蛋白质对于细胞内存活和液泡运动穿过含沙门氏菌液泡（SCV）的膜很重要。由两个T3SS传递到宿主细胞中的效应蛋白促进了细菌在宿主组织内的进入，存活和复制。沙门氏菌诱导肌动蛋白细胞骨架的起伏和巨胞饮作用，以促进细菌吸收到非吞噬细胞中，而SPI-1T3SS效应器在进入后逆转了这些变化[6]。

1.3SpiC蛋白功能研究

沙门菌是一种兼性的细胞内病原体，可以在多种吞噬和非吞噬细胞中发现，并且能够在其中存活和复制。为了建立这种细胞内生态位，T3SS1和T3SS2起着主要作用。T3SS1和T3SS2分别由毒力岛1（SalmonellaPathogenicityIslands1,SPI-1）和SPI-2编码。

沙门菌能够在宿主细胞中复制增殖是由于沙门菌毒力岛2（SPI2）III型分泌系统的作用，多种毒力因子和效应因子通过T3SS2跨SCV膜易位到被感染宿主细胞的细胞质中，并与宿主细胞中的蛋白质相互作用，对抗宿主细胞的先天免疫防御，支持其存活和持续感染的复制。而SPI-2在介导SseB，SseC以及SseD的体外分泌过程中，spiC基因起着至关重要的作用[7]。

SpiC作为一种毒力因子是Spi/SsaT3SS2系统分泌到巨噬细胞细胞质中的SP2编码蛋白。在沙门菌中表达的spiC蛋白是转位蛋白SseBC的调控蛋白或伴侣蛋白。沙门菌spiC缺失突变体及其互补菌株在低pH条件下进行胞外生长，诱导分泌SPI2编码的蛋白。SpiC被T3SS2分泌