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胱抑素C原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

唐红卫;刘一凡;孙禅;端永艳;李迪;李绵洋;王成彬

【摘要】目的：构建胱抑素C(cystatinC，Cys-C)原核表达载体并表达、纯化、

鉴定目的蛋白。方法根据GeneBank报道的Cys-C基因序列，采用RT-PCR技术

从人胚肾细胞系HEK293中获得Cys-C的cDNA序列，经PCR、酶切及测序确认

最终获得重组载体pET-30a(+)-CysC，转化大肠埃希菌Rosetta，通过异丙基-β-

D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalac-topyranoside，IPTG)诱导表达、

经镍柱亲和层析法纯化获得Cys-C融合蛋白。结果序列分析表明，人Cys-C基因

成熟肽编码区编码122个氨基酸；与GeneBank(NM-000099.2)中已报道的序列

有100%的同源性。经IPTG诱导表达，SDS电泳和ELISA分析显示，表

达的融合蛋白占菌体蛋白总量的20%，重组蛋白相对分子质量约为20000，经

Ni2+-NTAagarose纯化获得SDS电泳下单一条带并与商品化的人Cys-C

单抗呈特异性反应。结论在大肠埃希菌中获得了Cys-C的表达，并经镍柱亲和层

析得到较纯的胱抑素。%ObjectiveToconstruct,expressandpurifythe

prokaryoticexpressionvectorcystatinC(Cys-C).MethodsThecDNA

sequencesofCys-CgeneinhumanembryonickidneycelllineHEK293

weredetectedfromGeneBankbyRT-PCR.TherecombinantvectorpET-

30a(+)-CysC,identifiedbyrestrictionenzymerestrictionandsequencing,

wastransformedintoE.coli.TheCys-CfusionproteinwasinducedbyIPTG

andpurifiedbyNi-chelatingaffinitychromatography.ResultsSequence

analysisshowed122aminoacidsinpeptide-encodedhumanCys-C,which

isconsistentwiththereportedsequencesinGeneBank(NM-000099.2).

TheexpressionofCys-CgenewasinducedbyIPTG.SDSandELISA

showedthattheexpressedfusionproteinaccountedfor20%ofthetotal

bacterialprotein.Themolecularweightofrecombinantproteinwas20000.

TheNi2+-NTAagarose-purifiedSDSbindcouldspecificallyreact

withthecommercially-availablehumanCys-Cmonoclonalantibody.

ConclusionCys-CcanbeexpressedinE.coliandpurifiedbyNi-chelating

affinitychromatography.

【期刊名称】《解放军医学院学报》

【年(卷),期】2013(000)010

【总页数】4页(P1055-1058)

【关键词】胱抑素C;基因表达;大肠埃希菌;镍柱亲和层析

【作者】唐红卫;刘一凡;孙禅;端永艳;李迪;李绵洋;王成彬

【作者单位】解放军总医院临检科，北京100853;中南大学湘雅医学院医学检验

系，湖南长沙410013;深圳康美天鸿有限公司，北京102308;深圳康美天鸿有限

公司，北京102308;深圳康美天鸿有限公司，北京102308;解放军总医院临检科，

北京100853;解放军总医