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小麦ATG8的原核表达及其抗血清制备

吴洪波;刘刚;张路路;王冬梅

【摘要】TotalRNAwasisolatedfromwheatvarietyL10andreverse

transcriptionbyusingtheanchoredprimersinthispapertofurther

understandthebiologicalfunctionoftheautophagygeneATG8from

wheat.AndthentheATG8wereamplifiedbyPCRandthenclonedintothe

PMD19-Tvector,oneofwhichwassubclonedintotheexpressionvector.

Therecombinantplasmidwasidentifiedbysequencinganddigestionof

restrictionenzymes.There-combinantexpressionvectorwasconstructed

andtransformedintoE.colistrainRoseta(DE3)subsequently,then

throughIPTG-inductioninhostbacteriaE.coliRosetta-gamiB(DE3)and

detectedbySDS.Therabbitanti-ATG8antibodywaspreparedand

wasdetectedbyWesternBlottinganalysis.TheATG8wereobtainedpartly

andsuccessfullyexpressedintheprokaryoticexpressionsystem.The

experimentofferedfoundationtothestudyingofautophagyandfunction

ofATG8geneinwheat.%提取小麦品种L10的总RNA,进行反转录,其产物用于

探究自噬基因ATG8的生物学功能.用PCR方法克隆ATG8,将克隆的ATG8亚克隆

至表达载体PMD19-T,酶切后切胶回收,然后把产物测序鉴定,转化宿主菌E.coli

Rosetta-gamiB(DE3),构建原核表达系统,将融合蛋白纯化后制备其兔抗血清,然后

利用WesternBlotting技术对兔抗血清进行检测,鉴定了该抗血清的结合特异

性.ATG8抗体的成功制备,为小麦中ATG8基因和自噬功能的研究奠定了基础.

【期刊名称】《华北农学报》

【年(卷),期】2013(028)001

【总页数】5页(P101-105)

【关键词】ATG8;免疫印迹;抗血清;融合蛋白;原核表达

【作者】吴洪波;刘刚;张路路;王冬梅

【作者单位】河北农业大学生命科学学院,植物逆境生理研究室,河北保定071001;

河北农业大学生命科学学院,植物逆境生理研究室,河北保定071001;河北农业大学

生命科学学院,植物逆境生理研究室,河北保定071001;河北农业大学生命科学学院,

植物逆境生理研究室,河北保定071001

【正文语种】中文

【中图分类】Q942

自噬(Autophagy)指细胞在营养缺乏或应激条件下，通过降解细胞内衰老的长寿命

蛋白质、受损伤的细胞结构和细胞器，为细胞的重建、再生和修复提供必需原料，

实现细胞的再循环和再利用，是生物体内一种重要的防御和保护机制，是真核生物

中高度保守的一类亚细胞降解途径[1-2]，在维持细胞内生理平衡的过程中发挥重

要作用。在植物中，自噬主要发生在液泡中，首先细胞浆中出现大量包裹着细胞浆

和细胞器的双层膜空泡结构，然后溶酶体对空泡内成分进行降解。最近有对拟南芥

基因组进行的分析表明，至少有36个基因和酵母的AuTophaGy(ATG)基因有同

源性。并且有研究发现，细胞自噬在参与饥饿反应的同时，还在生物体生长发育、

免疫防御、细胞程序性死亡、肿瘤抑制、预防神经退行性病变等方面有非常重要的

作用[3-7]。ATG8定位于自噬体的内膜，随同自噬体一同进入液泡而被降解，常

常作为研究