绿孔雀检疫技术 第1部分：禽副黏病毒实验室检测技术规范.docxVIP

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DB53/TXXXX—2021

绿孔雀检疫技术

第1部分：禽副黏病毒实验室检测技术规范

重要提示：本检测技术规范中，氯仿有中等毒性，操作时应在通风条件下进行并戴手套和口罩，不小心接触皮肤应立即冲洗；凝胶电泳若使用溴化乙啶（EB）作核酸染色剂，操作时应戴手套和口罩，被EB污染的物品要进行无害化处理；操作焦碳酸二乙酯（DEPC）应戴手套和口罩并在通风条件下，不小心接触皮肤应立即冲洗。由于新城疫病毒可引起人一过性结膜炎，采样及检测人员应佩戴口罩和防护眼镜，并采取必要的消毒措施。本文件中凡接触病毒样品的检验器材、废弃物及其包装物均应做消毒或灭菌无害化处理，以免污染环境或扩散病毒。

1范围

本文件规定了绿孔雀（Pavomuticus）检疫技术中禽副黏病毒实验室检测技术涉及的总则、仪器设备和试剂、样品、试验步骤和试验数据处理。

本文件适用于绿孔雀检疫技术中禽副黏病毒实验室检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，标注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不标注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

NY/T1948兽医实验室生物安全要求通则

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

禽副黏病毒Avianparamyxoviruses

一类感染家禽和野禽的单链负股RNA病毒，属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒亚科（Paramyxovirinae）、禽腮腺炎病毒属（Avulavirus），包括至少禽副黏病毒1~9血清型，其中禽副黏病毒1型又称作新城疫病毒（Newcastlediseasevirus），其致病性最受关注。

3.2

F蛋白酶切位点CleavagesiteofFprotein

新城疫病毒融合蛋白（F）的F2亚基（位于F氨基端）与F1亚基（位于F羧基端）之间被宿主细胞蛋白内切酶识别的一个短肽，由113～117位氨基酸残基组成，其中113～116位可能含多个碱性氨基酸，如精氨酸（R）或赖氨酸（K）。

3.3

病毒血凝试验Viralhemagglutinationtest

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利用有血凝活性的病毒与特定动物的红细胞结合而使红细胞凝集（即红细胞不再自然下沉汇集）的特性，测定病毒效价即滴度的方法。

3.4

病毒血凝抑制试验Viralhemagglutinationinhibitiontest

使用抗体阻断或抑制病毒的血凝活性，用于测定血清抗体效价或病毒种类的一种方法。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

AMV：禽成髓细胞瘤病毒Avianmyeloblastosisvirus

cDNA：互补DNAcomplementaryDNA

DEPC：焦碳酸二乙酯Diethypyrocarbonate

dNTP：脱氧核苷酸Deoxyribonucleotidetriphosphate

EB：溴化乙啶Ethidiumbromide

F：融合蛋白Fusionprotein

HA：血凝Hemagglutination

HAU：血凝单位Hemagglutinationunit

HI：血凝抑制Hemagglutinationinhibition

L：大蛋白（RNA聚合酶）Largeprotein

M：基质蛋白Matrixprotein

NDV：新城疫病毒Newcastlediseasevirus

PBS：磷酸缓冲盐溶液Phosphate-bufferedsaline

PCR：聚合酶链式反应Polymerasechainreaction

RBCs：红细胞Redbloodcells

RNA：核糖核酸Ribonucleicacid

RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应Reverse-transcriptionpolymerasechainreactionSPF：无特定病原体Specificpathogenfree

5总则

5.1采用鸡胚接种方法从绿孔雀检测样品分离禽副黏病毒。

5.2取5.1得到的鸡胚尿囊液做病毒血凝（HA）试验和血凝抑制（HI）试验，确定分离毒株的种属和血清型（亚型）。

5.3用RT-PCR扩增分离毒株的RNA聚合酶（L）基因和基质蛋白（M）基因，对禽副黏病毒及其第1血清型（新城疫病毒）分别做出鉴定。

5.4对5.2或5.3确定的新城疫病毒分离株，采取RT-PCR扩增其融合蛋白（F）基因，再做测序分析，对新城疫病毒分离株做出毒力判定。