病毒转基因技术原理腺相关病毒 (2).ppt

rAAV载体应用于基因校正、基因阻断治疗疾病或生产转基因家畜、用于农业和研究的大型动物等具有无可比拟的优势，如：介导的基因打靶的效率高达1％、高于质粒载体转染或电转化，宿主范围广泛，可利用的多种亚型等。主要缺陷是大约10％仍是随机整合、具有潜在的致死或致癌效应。研究显示可采用成体干细胞并在体外筛选特异打靶克隆用于疾病治疗。第二部分基因打靶型腺相关病毒载体第32页,共46页，星期六，2024年，5月策略3细胞内整合表达第33页,共46页，星期六，2024年，5月纯化（三种方法）离子交换色谱法（IEXchromatography）：原理是依据在某一PH条件下，不同血清型的AAV的衣壳蛋白的电荷不同，因而，可以利用这一技术将不同的血清型的AAV分离纯化.优势:具有快速、规模化、可重复性以及适用于不同血清型病毒纯化的。缺点:在于需要摸索盐和PH浓度，以利于AAV病毒颗粒结合于IEX离子柱，而且这些条件依据不同的血清型而有所变化；另外常需要多步骤才能获得高纯度的rAAV。第三部分纯化和定量第34页,共46页，星期六，2024年，5月纯化（三种方法）受体特异性的亲和纯化（Receptor-specificaffinitypurification）：Heparansulfateproteoglycan(HSPG)是AAV-2感染细胞的受体，因此肝素亲和色谱分析法（Heparinaffinitychromatography）利用AAV-2和细胞特定受体结合这一特点，进行AAV-2的纯化，可获得高滴度和高纯度的纯化产物并可以用于临床试验，这也是rAAV-2在临床试验中作为使用最广的原因之一。依据同样原理，mucin被作为亲和配体以纯化AAV-5。缺点是不同的血清型的受体不同，因此，适用范围较窄。第三部分纯化和定量第35页,共46页，星期六，2024年，5月纯化（三种方法）AVB葡聚糖凝胶亲和色谱法：以AAV衣壳中高度保守的表位为基础，制备的单链抗体（14kDa）并在酵母中表达纯化后铰链到葡聚糖凝胶，以纯化AAV的多个血清型（如AAV-1，2，3，5和8）。第三部分纯化和定量第36页,共46页，星期六，2024年，5月定量采用含Rep/cap基因的细胞并接种于96孔细胞培养板，用AdV辅助病毒感染后，系列稀释的rAAV接种并用TCID50计算终点滴度，同时联合作为标准检查病毒基因滴度的qRT-PCR技术。或采用rHSV表达Rep/cap基因作为辅助病毒的方法，可选用更多的细胞类型用于定量。第三部分纯化和定量第37页,共46页，星期六，2024年，5月具有复制能力的rcAAV(replication-competentAAV)需要对终产物检测是否具有复制能力的rcAAV(replication-competentAAV)，这通常是由于载体与细胞系或辅助质粒中存在互补序列造成，可影响病毒载体的表达。常将rAAV制备物稀释后感染293细胞（或其它缺乏AAV基因的合适细胞），并在辅助病毒存在情况下作用48或72h，仅其中的rcAAV才能复制，收集细胞，冻融后的产物重复感染293细胞2次以上，用针对AAV的ITR区和rep基因的引物进行qRT-PCR检测。第三部分纯化和定量第38页,共46页，星期六，2024年，5月第三节腺相关病毒载体的医学应用生物医学的各种基础研究基因治疗病毒学和分子生物学体内基因转移和表达研究rAAV载体的构建、生产和功能评价，临床前研究，人体临床试验，离体细胞水平的临床前和临床研究肿瘤治疗rAAV载体的生物分布和应用途径与细胞和基因治疗等的相关研究第39页,共46页，星期六，2024年，5月rAAV载体的DNA在细胞内常存在于染色体外，而且在体内持续存在的时间较长，可以持久表达外源基因第40页,共46页，星期六，2024年，5月基因治疗单基因遗传病肿瘤神经系统疾病视网膜疾病心血管疾病（心衰）关节炎慢性紊乱传染性疾病第41页,共46页，星期六，2024年，5月第42页,共46页，星期六，2024年，5月Glybera(alipogenetiparvovec)becamethefirstgenetherapydrugtobeapprovedforcommercialuseinTheEuropeanUnionwhatdoesGlyberadoandhowdoesitwork?It’sbeenapprovedforpatientswiththerare