改良M199培养基培养Vero细胞及狂犬病病毒的效果-细胞生物学论文-生物学.pdfVIP

改良M199培养基培养Vero细胞及狂犬病病

毒的效果-细胞生物学论文-生物学论文

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199培养基是Morgan等于1950年开发的培养基，其广泛应

用于各类细胞的培养及相关病毒性疫苗的研发生产。Vero细胞是世

界卫生组织和我国生物制品规程认可的用于疫苗生产的细胞系。与其

他细胞基质相比，Vero细胞来源方便，无外源因子污染，对多种病

毒敏感，病毒增殖滴度较高，是很多病毒的理想培养基质，广泛应用

于人和动物疫苗的生产。

Vero细胞的生长状态直接影响相关病毒性疫苗的生产效率和疫

苗质量，因此，培养基的筛选显得尤为重要。

本研究使用的改良M199培养基是以GibcoM199培养基为基础，

通过调整氨基酸等营养成分的配比而制成的培养基。本实验通过比较

改良M199培养基和进口M199培养基培养Vero细胞及狂犬病病

毒的效果，以期获得更适应Vero细胞高密度培养的培养基。

1材料与方法

1.1细胞及病毒Vero细胞及狂犬病病毒aG株均由长春生物

制品研究所有限责任公司提供。

1.2实验动物SPF级昆明小鼠，雌性，55日龄，体重11～18

g，由长春生物制品研究所有限责任公司实验动物中心提供，动物许

可证号：SCXK（吉）2011-0003。

1.3主要试剂改良M199培养基由无锡市美迪生物制品有限

公司提供；进口M199培养基由国外某公司提供；胰酶购自美国

Gibco公司；新生牛血清购自武汉三利生物技术有限公司。

1.4细胞培养及形态观察取已长满单层的Vero细胞，加入0.

25%胰酶消化，按1∶6传代，以6104个／ml的密度接种于新

的T25细胞培养瓶中，分别用含5%新生牛血清的改良M199培养

基和进口M199培养基，置37∶恒温培养箱中静止培养。每隔24h

于倒置显微镜下观察细胞的生长状态。

1.5细胞计数与活力测定细胞长成致密单层时，消化计数，共

计数3次，取平均值；同时采用台盼蓝染色法测定细胞活力。细胞

活力（%）=活细胞数／（活细胞数+死细胞数）100%1.6病毒接

种及培养细胞长成致密单层后，弃去培养液，分别加入含1%新生

牛生血清的改良M199培养基和进口M199培养基，再分别按0.1

MOI接种狂犬病病毒aG株，置33∶恒温孵箱中静止培养。

1.7病毒滴度的测定病毒接种48h后，每隔12h采样，每隔

3d更换1次维持液。按照《中国药典》三部（2010版）规定，采

用小鼠脑内滴定法测定狂犬病病毒滴度。

2结果

2.1不同M199培养基培养的Vero细胞的形态倒置显微镜

下观察可见，使用改良M199培养基培养的Vero细胞较进口M199

培养基培养的Vero细胞形态更规则，皱缩死细胞也相对较少，见图

1。

2.2不同M199培养基培养的Vero细胞的增殖情况与活力

两种培养基培养72h时，Vero细胞均已长成致密单层，使用改良

M199培养基培养的细胞密度平均值（5.13105个／ml）高于进

口M199培养基（4.02105个／ml），细胞活力平均值（98.53%）

也高于进口M199培养基（96.24%）。

2.3不同M199培养基培养的狂犬病病毒的滴度检测结果显

示，使用改良M199培养基培养狂犬病病毒，病毒增殖更快，滴度

更高，峰值可达109logLD50／ml，明显高于使用进口M199培养

基培养的病毒滴度，见图2。

3讨论

Vero细胞是由世界卫生组织推荐用于生产人用生物制品的传代

细胞系，目前广泛应用于规模化人用疫苗的生产，包括狂犬病疫苗和

重组蛋白的生产。为了获得高质量的病毒收获液，首先需获得高密度

的细胞。与其他体外培养的哺乳动物细胞一样，Vero细胞的生长对

环境条件的要求较高，因此，选择合适的培养基十分重要。本实验比

较了改良M199培养基和进口M199培养基培养Vero细胞及狂犬