第七章 分子生物学研究法（上）.ppt

电击法电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的DNA进入细胞质。将生长至对数中期的E.coli菌液冷却至4℃后离心，洗菌后用10%的甘油悬浮，将高密度菌液（~2×1010/ml）置于特制的电极杯中进行电击。获得最大转化效率时场强一般为12.5~15kV/cm，时间跨度一般为4.5~5.5毫秒。电击转化与温度有关，一般在0~4℃进行。由于转化载体上常带有LacZ基因，多用带有不同抗生素（常用的抗生素包括氨苄青霉素、卡那霉素和四环素等）的选择性培养基结合α-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。*转基因西红柿转基因西红柿是第一种上市的转基因食品（1994年）。以前，农民要趁西红柿还没有成熟，果实还是绿色的时候就采摘下来。没有成熟的西红柿被运送到商店后，喷上乙烯将它们催熟，变成红色再摆出去卖。这种人工催熟的西红柿没有自然成熟的西红柿好吃。为什么不等西红柿成熟、变红再采摘呢？因为西红柿成熟后，皮也软了，运输过程中容易破。能不能让成熟的西红柿皮不变软呢？西红柿的皮变软，是因为有一种叫做多聚半乳糖醛酸酶的酶把细胞壁中的胶质给分解了。科学家们把编码这种酶的基因克隆出来，测定了它的序列。然后合成一个和它相反的“反义基因”。把“反义基因”转入到西红柿细胞中去，会干扰原来基因的活动，让它再也没有办法合成多聚半乳糖醛酸酶，细胞壁中的胶质不会被分解掉，西红柿即使成熟了，皮也不会变软。我们就可以等到它自然成熟了再采摘，不用担心不好运输。这样，自然成熟的转基因西红柿吃起来就要比人工催熟的普通西红柿好吃。这种转基因西红柿不仅容易运输，而且可以存放很长时间也不会坏。用转基因西红柿做的番茄酱比较稠，吃起来口感好，这是因为番茄酱的稠度和细胞壁中胶质的含量有关，胶质含量高，稠度也高。还有，这种转基因西红柿不容易发霉，可以避免因为吃了发霉的西红柿而把霉菌分泌的毒素吃进去。由于转入的“反义基因”只干扰聚半乳糖醛酸酶的基因，不会干扰其他基因，因此，转基因西红柿的营养成分没有发生变化。*常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。*pBR322质粒载体4.3KB，装载量为*蓝白斑筛选蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽（即α肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz的基因，lacz中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子；编码α肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码α肽链的功能活性。虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz的质粒后，质粒lacz基因编码的α肽链和菌株基因组表达的Ｎ端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即α-互补。操作中，添加IPTG(异丙基硫代-β-Ｄ-半乳糖苷)以激活lacz中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA（即目的片段）与含lacz的载体连接时，会插入进MCS，使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。含X-gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样，一次筛选可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。*此MCS位于编码α肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码α肽链的功能活性。*设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌/v_show/id_XMzcwMjc2NzMwOA==.html?refer=seo_operation.liuxiao.