分子克隆完整版本.pptVIP

应用Cosmid作载体进行基因克隆的一般程序穿梭载体(shuttlevectors)是指能在两种不同的生物中复制的载体。例如既能在原核生物(如大肠杆菌)中复制，又能在真核细胞(如酵母)中复制的载体。因此，这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列(Autonomouslyreplicatingsequence,ARS)以及选择标记性状，具有多克隆位点。通常穿梭载体在细菌中用于克隆、扩增克隆的基因，在酵母菌中用于基因表达分析。穿梭载体第三节分子克隆常用的载体BAC载体是基于细菌的性因子(F因子)质粒的一些特点构建的。F因子是细菌细胞内能自我复制的质粒，约100kb，它能在细菌接合时转移1000kb的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构成的BAC载体，可用于克隆100kb以上的DNA片段。带有外源片段的BAC载体在细菌细胞中通常仅单个拷贝，这一特点有利于保持DNA大分子，尤其是重复序列多的DNA大分子，在细胞内稳定复制而不发生重组。BAC载体本身分子量小，如由小F质粒构建的载体pBeloBAC11全长7.4kb，仅带有自我复制、控制拷贝数(repE)及质粒分配(parE，parA,parB)所必须的最少序列。BAC载体还具有氯霉素抗性选择基因及多克隆位点。在多克隆位点两侧，还有T7及SP6启动子位点，用于制备RNA分子，进一步分析克隆的基因表达，作为染色体步行的探针，以及序列测定克隆的片段。细菌人工染色体第三节分子克隆常用的载体酵母人工染色体酵母人工染色体（yeastartificialchromosome，YAC）是另一类酵母穿梭载体。同YEp载体一样具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。YAC还具有酵母菌染色体的一些特点。YAC可以接受100-1000kb的外源DNA片段，这一特点使YAC成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的重要工具，并促进了发展人类人工染色体(humanartificialchromosome，HAC)的研究。第三节分子克隆常用的载体原核表达载体的构建为了使克隆基因获得正确表达，转译功能性蛋白，在目的基因与载体重组连接时，目的基因编码的方向必须与载体DNA启动子方向相同，并要保持目的基因转译的相位不产生错误，保持原有的阅读框架，才能正确转译成氨基酸序列正确的功能蛋白。第三节分子克隆常用的载体为确保原核细胞可识别被克隆的真核基因，应采用原核细胞的强启动子和核糖体结合位点，且必须置于该基因的上游邻近处，于该基因的下游还应设置强终止子，基因的两侧应有不同的限制性酶切位点，以便定向插入，同时还应具有标记基因以便克隆选择。表达载体在E.coli表达动物或植物基因P起动子R核糖体结合位点T终止子第三节分子克隆常用的载体原核细胞表达载体的类型非融合型pKK223-3结构分泌型PINⅢ-ompA1结构融合蛋白表达载体pGEX结构包涵体型pBV220结构融合蛋白表达载体非融合型表达载体分泌型表达载体包涵体型表达载体第三节分子克隆常用的载体真核细胞表达载体的种类载体的类型质粒型载体病毒载体整合型表达载体游离型表达载体瞬时表达载体稳定性表达非复制型表达载体细胞裂解型表达载体第三节分子克隆常用的载体几种常用的真核表达载体逆转录病毒载体逆转录病毒（retrovirus，RV）载体是目前唯一的RNA病毒载体，在鸟类和哺乳动物中现已发现许多逆转录病毒，如鸟类的脾坏死病毒(SNV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、鼠类的乳腺瘤病毒(MMTV)等。第三节分子克隆常用的载体痘类病毒载体痘苗病毒可不依赖宿主细胞，独立于细胞质中（而不在核中）进行复制和转录，无致癌性。第三节分子克隆常用的载体HSV-I单纯疮疹病毒载体是一类双链DNA病毒，有80个以上基因，其中以HSV-I型备受关注。HSV-I基因组较大，可达150kb，许多基因均可缺失，但病毒仍有复制能力，因此为大片段外源基因的插入提供了条件，且插入容量大，至少可插入30kb的外源基因。第三节分子克隆常用的载体真核细胞中的克隆载体在酵母细胞中常用的克隆载体在大肠杆菌中表达，具有较高的拷贝数具有遗传标记具有限制酶切位点根据复制方式不同：整合型（YIP）、复制型（YRP）、附加体型（YEP）。第三节分子克隆常用的载体动物细胞基因