基因工程复习资料.doc

基因工程（geneticengineering）：就是在分子水平上，提取（或合成）不同生物的遗传物质（基因），在体外切割，再和一定的载体拼接重组，然后把重组的DNA分子引入细胞或生物体内，使这种外源DNA（基因）在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要繁殖扩增基因或生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并能稳定地遗传给下代。

2、基本技术路线：分（离目的基因）切（割目的基因和载体）接（连目的基因和载体）

转（入宿主细胞）筛（选阳性克隆）表（达目的基因）

基因工程的基本要素：目的基因、克隆载体、工具酶、受体细胞

载体(vector)：基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。

作为克隆载体必须具备的条件：至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。应有一个或几个限制性内切酶的单一识别位点，以供外源DNA的插入。应有一个或多个利于检测的遗传表型，易于识别和筛选。如抗药性、显色表型等，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。适当的拷贝数。

载体的分类：按载体的来源分：质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、植物病毒载体、动物病毒载体、人工染色体等。按用途分：克隆载体（clonevector）：主要用于扩增或保存DNA片段，是最简单的载体，其上有复制子即可。表达载体（expressionvector）：用于一个基因的蛋白表达，是在常规载体的基础上衍生而来，这类载体既有复制子，更要有强启动子。穿梭载体（shottlevector）：含有两个不同的复制子，能在两类不同的受体细胞中复制。

质粒载体的生物学特性：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的双链共价闭合的环状DNA分子，依赖宿主细胞的存在。

pBR322的优点：1、具有较小的分子量，4363bp。2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号：TetrAmpr插入失活效应3、具有较高的拷贝数。

pBR322质粒的结构来源：来自pSCl01的四环素抗性基因Tetr；来自ColEl的衍生物pMBl的松弛复制起点ori；来自pSF2124的氨苄青霉素抗性基因Ampr。

pUC18和pUC19载体的优点：具有较小的分子量（2.685kb）和更高的拷贝数、抗氨苄青霉素、可进行蓝白斑选择、有MCS。

pUC系列的质粒载体，包括以下四个部分：（1）改进的pBR322的复制起点(ori)（2）Ap基因，但DNA序列发生变化，不再含原来限制性核酸内切识别位点（3）lacZ`基因：大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及其编码的α-肽链的DNA序列（4）在lacZ`基因内部靠近5`端有一段MCS区段。

筛选方法：插入失活，蓝白斑筛选，定向克隆。

λ噬菌体的结构特点：噬菌体结构：最常见的是具尾部结构的二十面体型、无尾部结构的二十面体型、线状体型。λ噬菌体的结构缺点：（1）基因组太大。（2）酶切点太多。如：它有5个EcoRⅠ位点，7个HindⅢ位点。（3）野生型只能接纳一定长度的DNA，相当于λ噬菌体的75-105%，那么只能接纳49kb×5%=2.45kb的DNA。

λ噬菌体分子特点：（1）温和噬菌体，长度为48502bp；（2）双链线性DNA；（3）具有cos位点，可以环化。?DNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为cos位点。

λ噬菌体的包装限制范围：正常野生型λDNA长度的75%—105%。只能容纳一定长度的DNA。36kb—51kb之间。插入的载体一定要有筛选标记。

插入型载体：外源DNA直接插入已构建载体中，如?gt10、?gt11、Charon6等。插入型载体只能插入较小的外源DNA片段（0-11kb)。

替换型载体：λDNA进一步去掉大多数的非必需片段，保留了作为载体的必需的左臂（含与包装蛋白有关的基因）和右臂（含与裂解生长有关的基因）。在左右臂间用一段填充片段替换了与溶源循环有关的基因片段。

λ-DNA载体的优点：λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效感染大肠杆菌、λ-DNA作为载体，其装载外源DNA的能力为23kb，远远大于质粒的装载量、重组λ-DNA的筛选较为方便。

柯斯质粒结构组成（5－7kb）：质粒的复制子抗药性基因几个限制性酶的单一位点cos序列和控制包装的序列。

柯斯质粒的优点：1）具有?噬菌体的特性：有λ噬菌体的高效感染能力2）具有质粒载体的特性：具有质粒复制子，在寄主细胞内能象质粒一样复制；具有抗生素的抗性基因，可作为筛选标记。3）有较高容量的克隆能力，30-45kb

M13结构和组成特点：外型呈丝状，由外壳包装蛋白和正链DNA组成。不裂解宿主细胞，但抑制其生长。DNA全长6407个核苷酸，有