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高效液相色谱分析技术及其新的发展与应用

余建军

(陕西科技大学生命科学与工程学院，西安710021)

1高效液相色谱法概述

高效液相色谱法（highperformanc，liquidchromatography，HPLC）是在经典液相色谱法

基础上发展起来的一种新型分离、分析技术。经典液相色谱法由于使用粗颗粒的固定相，填充

不均匀，依靠重力使流动相流动，因此分析速度慢，分离效率低。新型高效的固定相、高压输

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液泵、梯度洗脱技术以及各种高灵敏度的检测器相继发明，高效液相色谱法迅速发展起来。

高效液相色谱法与经典液相色谱法比较，具有下列主要特点：

（1）高效由于使用了细颗粒、高效率的固定相和均匀填充技术，高效液相色谱法分离效率

极高，柱效一般可达每米104理论塔板。近几年来出现的微型填充柱（内径lmm）和毛细管液

相色谱柱（内径0.05umm），理论塔板数超过每米105，能实现高效的分离。

（2）高速由于使用高压泵输送流动相，采用梯度洗脱装置，用检测器在柱后直接检测洗脱

组分等，HPLC完成一次分离分析一般只需几分钟到几十分钟，比经典液相色谱快得多。

（3）高灵敏度紫外、荧光、电化学、质谱等高灵敏度检测器的使用，使HPLC的最小检测

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量可达10～10g

（4）高度自动化计算机的应用，使HPLC不仅能自动处理数据、绘图和打印分析结果，而

且还可以自动控制色谱条件，使色谱系统自始至终都在最佳状态下工作，成为全自动化的仪器。

（5）应用范围广（与气相色谱法相比）HPLC可用于高沸点、相对分子质量大、热稳定

性差的有机化合物及各种离子的分离分析。如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、维生素、

抗生素等。

（6）流动相可选择范围广它可用多种溶剂作流动相，通过改变流动相组成来改善分离效果，

因此对于性质和结构类似的物质分离的可能性比气相色谱法更大。

（7）馏分容易收集更有利于制备

2色谱法分类

高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为

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分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。

根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流

动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极

性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。

2.1液-固色谱法（液-固吸附色谱法）

固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。

（1）液-固色谱法的作用机制

吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其表面常存在分散的吸附中心点。

流动相中的溶质分子X(液相)被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如

下交换反应：

X(液相)+nS(吸附)==X(吸附)+nS(液相)

其作用机制是溶质分子X(液相)和溶剂分子S(液相)对吸附剂活性表面的竞争吸附。

吸附反应的平衡常数K为：

K值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。

K值较大：表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。

发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。

（2）液-固色谱法的吸附剂和流动相

常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、

分子筛、聚酰胺等。

一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂(如硅胶、氧化铜)之间的作用力很

弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，

保留时间长。

对流动相的基本要求：

①试样要能够溶于流动相中

②流动相粘度较小

③流动相不能影响试样的检测

常用的流动相