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陕西医学杂志２００６年１Ｏ月第３５卷第１０期１２３５

论著・临床研究・

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增强型绿色荧光蛋白的基因克隆、表达及蛋白纯化

第四军医大学基础医学教学实验中心（西安７１００３３）

曲萍隋延仿叶菁张秀敏

摘要目的：研究增强型绿色荧光蛋白（ＥｎｈａｎｃｅｄＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ，

ＥＧＦＰ）基因在大肠杆茵中的基因克隆、重组表达及纯化。方法：采用ＰＣＲ方法克隆ＥＧＦＰ

全长ｃＤＮＡ序列，构建原核表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ一１一ＥＧＦＰ，经过ＤＮＡ序列测定证实其序列正

确，转化大肠杆茵ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＩｙｓＳ，通过异丙基硫代一Ｄ一半乳糖苷（ｉｓｏｐｒｏｐｙ—ｂｌｅｔａ—Ｄ—

ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ，ＩＰＴＧ）诱导表达，用谷胱甘肽一Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ层析法纯化ＧＳＴ—

ＥＧＦＰ融合蛋白。结果：成功地克隆了ＥＧＦＰ全长ｃＤＮＡ序列，并进行原核表达以及蛋白的

纯化，ＧＳＴ—ＥＧＦＰ的表达量占茵体蛋白量的４Ｏ以上。经纯化后纯度高于９Ｏ。茵体超声

裂解后上清液及其纯化产物在长波紫外线的照射下，发出明亮的绿色荧光。结论：本研究为

应用ＥＧＦＰ追踪细胞吞噬功能等动态活动奠定了实验基础。

主题词基因复制基因表达调控＠增强型绿色荧光蛋白

Ｇｅｎｅｃｌｏｎｅ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｎｈａｎｃｅｄ

ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ

ＤｅｐＡｒｔｍｅｎｔｏｆｐａｔｈｏｌｏｇｙ。ＳｃｈｏｏｌｏｆＢａｓｉｃＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＦｏｕｒｔｈＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

（Ｘｉ’ａｎ７１００３３）ＱｕＰｉｎｇＳｕｉＹａｎｆａｎｇＹｅＪｉｎｇｅｔａｌ

ＡＢＳＴＲＡＣＴＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｇｅｎｅｃｌｏｎｅ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＥＧＦＰ

（ＥｎｈａｎｃｅｄＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）ｇｅｎｅｉｎＥ．ｃｏｌｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＥＧＦＰｇｅｎｅｓｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｔＯｂｕｉｌｄ

ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｐＧＥＸ—ＥＧＦＰ．ＥＧＦＰ—ＧＳＴｗｅｒｅｐｕｒｉｆｉｅｄｗｉｔｈＧＳＴｒａｐＦＦｃｏｌｕｍｎｓ．

Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅＥＧＦＰ—ＧＳＴｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｉｓａｒｏｕｎｄ５３Ｏ００Ｄ．ＴｈｅＥＧＦＰ—ＧＳＴｓｏｌｕｔｉｏｎａｆｔｅｒ

ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｈｏｗｂｒｉｇｈｔｋｅｌｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｕｓａｇｅｏｆ

ＥＧＦＰｉｎｃｅｌｌａｃｔｉｏｎｓｈａｓｂｅｅｎｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．

ＫＥＹＷＯＲＤＳＧｅｎｅｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎＧｅｎｅｅｘｏｒｅｓｓｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ＠ＥＧＦＰ

绿色荧光蛋白（Ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，种报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋

ＧＦＰ）来源于海洋生物水母，在蓝光或紫外光下可白质在生物体内定位和转运等］。为了研究

发出荧光，近年来在生物化学和细胞生物学中成ＥＧＦＰ作为外源性蛋白质在抗原递呈细胞内的加

为应用最广泛的标记性蛋白质之一［１］，目前应用