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PMA在活茵检测中的应用

作者：朱延申

来源：《畜牧兽医科学》2018年第3期

摘要：本文主要介绍一种活茵检测方法，即叠氮溴化丙锭(PMA)偶联荧光定量PCR的一种

新的检测活菌的方法。为相关研究者提供理论参考。

关键词：叠氮溴化丙锭；活菌检测；因素；应用

中图分类号：R378.2文献标识码：Bdoi：10.3969/j.issn.2096-3637.2018.03.

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1叠氮溴化丙锭的介绍

叠氮溴化丙锭(PMA)是一种光敏反应染料，它对DNA具有非常高的亲和力。当细胞膜处于

不完整状态或者细胞已经死亡，细胞膜对外界的物质的进出就没有了选择性，PMA就可以顺利

进入细胞内，与DNA进行结合，在光照作用下发生交联反应。交联后的DNA就不能作为模板进

行扩增，残留在溶液中的未被结合的PMA在光照下与水分子形成羟胺化合物，从而阻止其与在

提取过程中活菌产生的DNA结合，影响检测结果。而对于活的细胞而言，细胞膜具有选择性，

PMA便不能进入细胞内与DNA进行交联反应。将PMA这种特性与荧光定量PCR技术进行偶联，

便可以实现对活菌的检测。

2影响活菌检测的因素

21采集的样品

PMA偶联荧光PCR技术对样品的要求比较高。有研究发现，环境中的样品，食品样品和临

床上的病料中常常含有一些无机物质．有机物质。这些物质的存在既可以降低PMA的有效浓度，

也可以干扰PMA与核酸的交联反应。详细的说，样品中的无机物和有机物会造成样品的浊度提

高，样品越浑浊，光的透过性就越差，越影响PMA与样品在光照条件下的交联反应。为了避免

和减少因样品采集带来的误差，Luo等人在一项研究中提出，要严格规范浊度的阈值，这样对

每一份样品检测具有更重要的意义和参考价值。有研究表明，当样品的浊度达到10个散射浊度

单位的时候，样品的浊度对于PMA交联DNA是没有影响的。当样品的浊度高于10个散射浊度时，

样品的浊度对于PMA交联DNA具有非常大的影响。

22PMA与DNA作用阶段

PMA与DNA作用阶段主要是指PMA进入细胞膜受损伤的过程和PMA结合DNA的过程。PMA是

一种对光较为敏感的染料，即便在普通光源下，也能降低PMA的有效浓度。因此，在PMA与细

胞核DNA作用的过程中要避光。在这个过程中，PMA的浓度、PMA与核酸的作用时间，温度等都

会影响最终的检测结果。有些学者在参考别的研究者活菌检测技术时，设置了同样的温度、浓

度和时间，但是结果却不甚理想。其主要原因是样品不同，最佳的PMA的浓度和作用时间也会

有很大的差异。如较低浓度时，PMA是不能够完全结合掉所有的死菌DNA，那么部分没有结合的

死菌的DNA便可以作为模板被扩增出来，从而造成活菌检测数据不准确。如果PMA的浓度过高，

PMA也可以渗入到活的细胞中，将部分活的细胞DNA结合掉，造成检测结果的不准确。因此，

无论是做哪一项活菌检测，PMA的浓度和作用时间等参数要先优化，后使用。PMA进入细胞的效

率和有效结合DNA的效率还与温度有关。有研究表明。在室温的条件下，PMA结合DNA的效率

最高。另外，PMA与细胞的作用时间也要考虑到位。作用时间过长，PMA也能够渗透到活细胞中，

造成结果的不准确。

23PMA与DNA的交联

在光照条件下，PMA与DNA能够发生交联反应。但是有效的交联反应仍然依赖于光源和光

处理时间的长短。光源的光谱不同时，PMA的激活效果也存在很大的差异。最为合适的光源是

光的波长能够有效激发PMA分解。研究表明，500~750w的金属卤素灯是最佳的光源。光照时，

样品要放在光下20~30cm处，保障PMA与样品中的DNA有效交联。但是值得注意的是，在较高

功率的卤素灯照射下，部分活菌会严重受热死亡。为了避免这种现象的发生，Vesper等人首次

将发光二极管代替卤素灯，这样既保障了激发PMA的最佳发射波长，又避免了热量造成的活菌

的死亡。光照时间是整个处理中不可小觑的环节。样品，实验条件的不同，光照时间也会有很

大的差异。一般情况下，光照时间控制在20min以内。光照时间过短，PMA与DNA的交联反应

不彻底，同时，残留在液体中的游离的PMA也不能完全失活。较长时间的光照时间又会引起活

菌的死亡。因此，需