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5—Aza—CdR对胃癌细胞p16基因表达的影响

目的：探讨5-Aza-CdR对人胃癌细胞p16基因启动子甲基化以及mRNA表

达的影响。方法：体外培养人胃癌细胞株MKN-28，分别用0.5、1.0、2.0、5.0μmol/L

的5-Aza-CdR与之孵育72h。甲基化特异性PCR检测处理前后p16基因启动子

甲基化水平。RT-PCR和Westernblot检测p16mRNA表达。结果：随着药物浓

度的增加，甲基化p16含量逐渐降低。而非甲基化p16逐渐增高。此外，5-Aza-CdR

处理后，p16mRNA和蛋白表达水平也随之增高。结论：5-Aza-CdR可逆转

MKN-28细胞株细胞中基因甲基化修饰状态，并上调其表达。

标签：5-Aza-CdR；肝癌细胞；RASSFIA基因；启动子甲基化

资助项目：湖南省教育厅科技计划项目（13C963）

胃癌是一种恶性肿瘤，它严重危害着人们的身心健康，给胃癌患者带来了很

大的身体危害及心理压力[1]。故本次研究利用5-Aza-CdR对体外培养的胃癌细

胞株MKN-28的p16基因启动子区进行去甲基化反应，进一步探讨胃癌细胞中

p16基因失活的机制以及5-Aza-CdR对其表达的调控作用。

1材料与方法

1.1主要试剂

5-Aza-CdR为Sigma产品，总RNA提取试剂为TRIzol，买自Invitrogen公

司，RT-PCR试剂盒买自TaKaRa公司，RPMI1640培养基为Hyclone产品。

1.2细胞培养与处理

胃癌细胞株MKN-28接种于RPMI1640培养基，在37℃、含有50ml/LCO2的

湿润空气的恒温密闭式培养箱中进行培养。实验时细胞处于对数生长期，活细胞

的数量要达到95%-100%。其中其培养瓶中加入含有不同浓度的5-Aza-CdR（0.5、

1.0、2.0、5.0μmol/L）进行孵育24、48、72小时，孵育结束后收集细胞，进行

实验。

1.3甲基化特异性PCR

蛋白酶K-苯酚抽取法从细胞中抽取DNA，利用紫外分光光度计检测DNA

的含量以及纯度，利用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的完整性，重复测试3次。

PCR反应条件为：特异性引物PCR的扩增条件为95℃下15min，95℃下40s，

60℃下40s，72℃下40s，共进行35个循环，最后稳定在72℃下10min。

1.4RNA提取与RT-PCR

将5-Aza-CdR处理的细胞收集起来，然后利用TRIzol试剂提取各组中

MKN-28细胞的总RNA。PCR测试的反应条件为[2]：在95℃下进行预变性，94℃

下变性40s，58℃下复性40s，72℃下延伸1分钟，总进行35个循环，72℃下最

后延伸6分钟。RT-PCR的产物利用琼脂糖胶进行分离，测试重复进行3次。

1.5Westernblot检测p16蛋白表达

将5-Aza-CdR处理的细胞收集起来，将总蛋白进行提取，其蛋白的含量使

用酚试剂法进行测定。以β-actin为内对照，利用条带密度值与内参照的密度值

进行比较，分析结果，实验重复三次[2]。

1.6统计学分析

采用SPSS15.0统计学软件处理数据，结果采用均数±标准差表示，多组比

较采用one-way方差分析并行Student’st检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1不同浓度5-Aza-CdR下调胃癌细胞甲基化p16水平

MKN-28中p16呈现出异常甲基化状态，p16基因在0.5μmol/L5-Aza-CdR

处理的条件下甲基化条带减弱，在浓度为1.0μmol/L的时候出现非甲基化条带，

仅有剩余部分呈现甲基化，随着浓度的进一步增加，非甲基化p16含量逐渐升高，

最后呈现出完全去甲基化状态。

2.2不同浓度5-Aza-CdR上调胃癌细胞中p16mRNA表达

5-Aza-CdR处理前的MKN-28