DB22T 2623.2-2017 黑木耳菌种区别性及真实性鉴定 第2部分：酯酶同工酶法　　.docxVIP

ICS65.020.01B05

备案号：56323-2017DB22吉林省地方标准

DB22/T2623.2—2017

黑木耳菌种区别性及真实性鉴定第2部分：酯酶同工酶法

VerificationofdistinctnessandgenuinenessforBlackwoodearspawnPart2:Esteraseisozyme

2017-06-12发布2017-08-12实施

吉林省质量技术监督局发布

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前言

《黑木耳菌种区别性及真实性鉴定》分为以下3个部分：

——DB22/T2623.1黑木耳菌种区别性及真实性鉴定第1部分对峙培养法

——DB22/T2623.2黑木耳菌种区别性及真实性鉴定第2部分酯酶同工酶法——DB22/T2623.3黑木耳菌种区别性及真实性鉴定第3部分SRAP法

本部分为第2部分：酯酶同工酶法。

本标准按照GB/T1.1—2009和GB/T20001.4—2015给出的规则起草。本标准由吉林省农业委员会提出并归口。

本标准起草单位：吉林农业大学、吉林省海外农业投资开发集团有限公司。

本标准主要起草人：姚方杰、张友民、方明、陈影、鲁丽鑫、王鹏、姚允武、于娅、刘宏宇、李丹、王晓娥、陈艳秋、刘迪、张伟彤、孔祥会、马晓旭、张媛媛、李玉。

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DB22/T2623.2—2017

黑木耳菌种区别性及真实性鉴定第2部分酯酶同工酶法

1范围

本标准规定了黑木耳菌种真实性鉴定酯酶同工酶法的原理、试剂和材料、仪器设备、样品、试验步骤、试验数据处理。

本标准适用于黑木耳菌种真实性的鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

NY/T1097食用菌菌种真实性鉴定酯酶同工酶电泳法

3术语和定义

NY/T1097界定的以及下列术语和定义适用于本文件。为了便于使用，以下重复列出了NY/T1097中的术语和定义。

3.1

菌种真实性genuinenessofspawn供检菌种和对照菌种的符合性。

[NY/T1097，定义3.1]

4原理

在生物中，酶的表达受遗传基因的调控。酯酶是多等位基因调控的酶类，在凝胶电泳中经聚丙烯酰胺凝胶的浓缩，在分子筛效应和电场的电荷效应作用下而发生分离。从食用菌菌丝体中提取的粗酶液经电泳后，进行酯酶的生物化学染色，不同的酯酶组分显示在凝胶的不同位置而形成酯酶同工酶酶谱。相同的菌种遗传背景相同，其酯酶同工酶酶谱也相同。因此可以用酯酶同工酶酶谱对黑木耳菌种的真实性进行鉴定。

5试剂和材料

5.1培养基：见附录A。

5.2酯酶同工酶上样缓冲液：4×ProteinNativePAGELoadingBuffer。5.3样品提取液（pH7.5）：见附录B.1。

5.4过硫酸铵：见附录B.2。

5.5分离胶缓冲液（pH8.9）：见附录B.3。5.6浓缩胶缓冲液（pH6.7）：见附录B.4。

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5.7分离胶母液：见附录B.5。5.8浓缩胶母液：见附录B.6。

5.9酯酶同工酶电极缓冲液：见附录B.7。5.10磷酸缓冲液：见附录B.8。

5.11酯酶同工酶电泳染色液：见附录B.9。

5.12液氮。

6仪器设备

6.1高速冷冻离心机（10000rpm以上）。6.2全温摇瓶柜：精度±0.1℃。

6.3垂直板电泳槽：凝胶面积（W×L）160×180mm。6.4稳压稳流电泳仪。

6.5分析天平：感量0.01g、0.0001g各一台。

7样品

7.1液体培养

直接将接种块接入三角瓶液体培养基中，25℃,120rpm振荡避光培养20d。培养基的制备参见附录A。

7.2酯酶同工酶样品制备

将振荡培养的黑木耳菌丝球过滤除去水分，获得供检黑木耳供试菌株与标准菌株的菌丝体各3份。称取菌丝体0.5g，加液氮研磨，将样品收集于1.5mL离心管中，加入0.5mL样品提取液（附录B.1）。将研磨后的样品在4℃下12000rpm，离心10min，取其上清液，将上清液和上