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Vol.19高等学校化学学报No.6
1998年6月CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES879～881
[研究简报]
以锌试剂显色法测定蛋白质的研究*
迟燕华李娜庄稼李克安童沈阳
(北京大学化学与分子工程学院,北京,100871)
关键词锌试剂,蛋白质,分光光度法
分类号O657.31
有关蛋白质染色测定的分光光度研究已有不少报道,其中有些已用于蛋白质的分析测
定[1～4].锌试剂常用于金属离子的分光光度法测定,但作为生物大分子分析试剂的研究,目
前还未见报道.实验表明,在pH4左右的缓冲溶液中,锌试剂与BSA反应生成有色复合物,
吸收光谱发生红移.由此,我们研究了锌试剂与蛋白质反应的基本条件,建立了以锌试剂测
定蛋白质的分光光度分析法,本法应用于人血清中总蛋白质量的测定,结果令人满意.
1实验部分
1.1仪器与试剂UV-265分光光度计(Shimadzu),724型可见分光光度计(上海光学仪器
厂),821型计(中山大学电子厂).锌试剂(二级),2.0×10-4/(水溶液);牛血清白
pHmolL
蛋白(BSA,Sigma);胃蛋白酶(Pepsin,中科院上海生化所,等电点1.0);C-球蛋白(C-Glob-
ulin,human,ServaCo.,cohn-FractⅡ);卵白蛋白(Albumin,中科院上海生化所,琼脂电
泳纯),溶菌酶(Lysozyme,Sino-AmericanBiotech,比活40000u/mg);糜蛋白酶(A-Chy-
,上海生化试剂站);胰蛋白酶(,上海生化试剂站).蛋白质均以0.9%
motrypsinTrypsin
NaCl溶液配制,置于1～4℃冰箱中保存.Britton-Robinson(缩写为B-R)缓冲溶液:在100
mL三酸混合液(磷酸、乙酸、硼酸,浓度均为0.04mol/L)中,加入指定体积的0.2mol/L
NaOH,即得相应pH值的缓冲溶液.
1.2实验方法在一系列25容量瓶中,分别加入5.0锌试剂和-缓冲溶液,摇
mLmLBR
匀,根据实验要求,加入不同体积的BSA标准溶液,以水定容,摇匀.在不同的实验条件下,
以试剂空白为参比,在564nm测定其吸光度.
2结果与讨论
2.1吸收光谱的变化锌试剂在pH4.1的缓冲溶液中为橙黄色,吸收峰为465nm.当加入
BSA后,溶液由黄色变为紫色,这表明锌试剂与BSA生成了复合物,复合物的吸收峰分别
为564nm和596nm,红移约100～120nm(如图1).在复合物的吸收峰波长处,吸光度与蛋
白质的量呈线性关系.据此,可以建立测定蛋白质的分析方法.
2.2反应条件的确定(1)缓冲体系的选择.对一系列不同类型的缓冲体系进行实验,结果
表明:在HAc-NaAc和B-R缓冲体系中,反应均能进行,其中选用B-R缓冲体系能提高锌试
剂-BSA复合物的稳定性和测定的灵敏度.
(2)的影响.固定锌试剂和的浓度,使其在一系列不同值的-缓冲溶液
pHBSAp
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