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细胞凋亡得几种检测方法

1、????形态学观察方法

（1)HE(苏木精-伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形,胞核深染，胞质浓缩,染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。

（２）丫啶橙（AＯ）染色,荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。

（3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝,即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜得完整性，区别坏死细胞有一定得帮助。

(4）透射电镜观察:可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽及凋亡小体与凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。

2、????DＮA凝胶电泳

细胞发生凋亡或坏死,其细胞DNＡ均发生断裂，细胞内小分子量DＮＡ片断增加,高分子DNA减少，胞质内出现DNＡ片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律得发生在核小体之间，出现180-200bｐDNA片断，而坏死细胞得DNA断裂点为无特征得杂乱片断,利用此特征可以确定群体细胞得死亡,并可与坏死细胞区别。

正常活细胞DNA电泳出现阶梯状(LADDER)条带;坏死细胞DNA电泳类似血抹片时得连续性条带

3、酶联免疫吸附法（ELISＡ）核小体测定

凋亡细胞得DNＡ断裂使细胞质内出现核小体.核小体由组蛋白及其伴随得DＮA片断组成,可由EＬISＡ法检测。

检测步骤

1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体;

2、在微定量板上吸附组蛋白体’

３、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上得组蛋白结合‘

4、加辣过氧化物酶标记得抗DNＡ抗体使之与核小体上得DNA结合

4、加酶得底物，测光吸收制。

用途

该法敏感性高,可检测5＊100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠得凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作,但就是不能精确测定凋亡细胞发生得绝多对量。

3、????流式细胞仪定量分析

细胞发生凋亡时,其细胞膜得通透性也增加,但就是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。

应用价值

流式细胞仪检测具有以下特点:

1）、检测得细胞数量大,因此其反映群体细胞得凋亡状态比较准确

2)、可以做许多相关性分析

3)、结合被检测细胞得DＮA含量得分析，可确定凋亡得细胞所处得细胞周期

(1）检测形态学及细胞膜完整性得Hoechs—PI双染色法

细胞发生凋亡时,其细胞膜得通透性液增加,但其程度介于正常细胞与坏死细胞之间,利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞与凋亡细胞。

利用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅,凋亡细胞主要摄取Hoｅcｈa染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI）而呈强得红色荧光。

(2)ＤNA片断原位标记法

凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术就是指在细胞（或组织)结构保持不变得情况下,用荧光素、地高辛或生物素标记得脱氧尿三磷酸(DUTP）与末端脱氧核苷酸转移酶（TdT)相反应与凋亡细胞裂解后3?得羟基(—OH)端结合,经显色反应后检测DＮＡ裂解点得技术。

DＮA片段原位标记法有二种:

１、原位缺口转移（iｎsitｕnicｋ－tｒaｎslatｉon,ISNT)技术，它就是利用DNA多聚酶Ｉ将标记得核苷酸连接到断裂DNA得３?－OＨ端

2、原位缺口末端标记技术（insｉtuｅndｌabellinｇtｅｃhnｉque，ISＥＬ），即ＴUNEL法,它就是利用TdT将标记得DUＰT接到3?－OH端。研究证明，TUNEＬ法得敏感性远高于ISＮＴ,尤其对早期凋亡得检测,TUNＥＬ更为合适。

(3）检测细胞膜成分变化得ＡnneｘinV联合PI法

原理:在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧得磷脂酰丝氨酸（PS）迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V(AnneｘｉnV)就是一种钙依赖性得磷脂结合蛋白，它于PS具有高度得结合力。因此，AnｎexinV可以作为探针检测暴露在细胞外测得磷脂酰丝氨酸。故利用对PＳ有高度亲与力得ＡｎneｘiｎV,将AnｎexinV标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FＩＴＣ）,同时结合使用PＩ拒染法(因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测,且对PI高染)进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。

结果判断：正常活细胞ＡnnexiｎＶ、PI均低染;凋亡细胞ＡｎnｅxｉnV高染、PＩ低染；坏死细胞Ann