原核表达及蛋白纯化方法 .pdfVIP

蛋白原核表达

预实验：摸索最适的诱导浓度、诱导温度

1.构建所需要的重组质粒，转化相应的表达菌株（如BL21，Rossetta），

挑斑菌液PCR验证。

2.分别挑取含有重组质粒和空载体的大肠杆菌Rossetta（或BL21）

单菌落至5mL新鲜的2×YT液体培养基（含100μg/mLAmp,50μg

/mLKan,34μg/mLCm）中，37℃摇床，180rpm培养过夜，即种

子菌。

3.将过夜种子菌按照1﹕100的比例转接到20mL新鲜的2×YT液体

培养基（含100μg/mLAmp,50μg/mLKan,34μg/mLCm）中，37℃

摇床，180rpm培养。

4.待菌液浓度达到OD为0.6~0.8时（约3h），加入IPTG至终浓

600

度为1mM，37℃摇床，180rpm培养4~6h。（最适的诱导浓度、诱

导温度，需要多次实验摸索再确定，不同的表达载体所需的IPTG浓

度及温度是不同的）

5.取100μL菌液，12，000g离心2min，弃上清，用40μLPBS悬

浮菌体，加入10μL5×SDSLoadingBuffer，95℃变性5min，记为

样品A（总蛋白）。

6.将剩下的20mL菌液离心弃上清，加入2mLPBS悬浮菌液，其

中1mL菌液备用，另1mL菌液转入1.5mL离心管中，12，000g离

心2min，弃上清，加入800μL超声波反应缓冲液，15%，超声1s，

间隔2s，反应5min，4℃，12，000g离心2min，取500μL上

清，在上清样品中取40μL上清加入10μL5×SDSLoadingBuffer，

95℃变性5min，记为样品B（可溶性蛋白）。

7.沉淀用PBS洗4-5次，以除去沉淀中的可溶性蛋白，用500μL裂

解缓冲液悬浮沉淀，取40μL沉淀，加入10μL5×SDSLoadingBuffer，

95℃变性5min，记为样品C（不可溶蛋白，即包涵体）。

8.SDS电泳分析蛋白

所需试剂：

2×YT液体培养基：

胰蛋白胨16g

酵母提取物10g

NaCl5g

加水定容至1L，调节pH值至7.2

PBS缓冲液

NaHPO•12HO（10mM）3.58g

242

KHPO（1.8mM）0.245g

24

NaCl（140mM）8.2g

KCl（2.7mM）0.2g

加水定容至1L，调节pH值至7.3

超声波反应缓冲液：现配现用

50mMTris•AcpH值7.5

10mMEDTA

5mMDTT

裂解缓冲液：

NaHPO•2HO（100mM）15.6g

242

Tris•HCl（10mM）1.2g

尿素（8M）480.5g

加水定容至1L

5×SDSLoadingBuffer

250mMTris•HClpH值6.8

5%β-巯基乙醇

10%SDS

0.5%溴酚蓝

50%