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植物硝酸还原酶（NR）活力测定（活体法）

一、原理

硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸

盐,产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α–萘胺（或萘基乙烯二胺）

在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。其反应如下：

生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶

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活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以Nμg·gh·为单位。NR的测定可分为活体法和

离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好

二、仪器与用具

分光光度计；真空抽气泵（或20ml注射器筒）；天平；单面刀片；保温箱（或恒温水

浴）；刻度试管（15ml）；移液管（5ml×2，2ml×8，1ml×2）。

三、试剂

1.亚硝酸钠标准液称取分析纯NaNO0.1000g水溶后定容至100ml，吸取5ml用水稀释定

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容至1000ml，即为每ml含NaNO5μg（亚硝态氮近似1μg/ml）的标准液。

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2.0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲液：KHPO19.24g，KHPO2.2g，加水溶解后定容至1000ml。

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3.1%（W/V）对-氨基苯磺酸溶液：称取10.0g加入250ml浓HCl中，用蒸馏水定容至1000ml。

4.0.2%（W/V）α-萘胺溶液：称取2.0gα-萘胺溶于250ml冰醋酸中，用蒸馏水定容至1000ml。

5.30%三氯乙酸溶液：75.0g三氯乙酸水溶后定容250ml。

6.KNO（0.1mol/L）、异丙醇（1%V/V）、磷酸缓冲液（0.1mol/L）混合液：称10.10gKNO

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溶于1000ml0.1mol/L的磷酸缓冲液中，再加10ml异丙醇混匀。

四、方法

1.标准曲线制作

取7支洁净烘干的15ml刻度试管按表13-1顺序加试剂，即配成0-2.0μg的系列标准亚

硝态氮溶液。摇匀后在30℃保温箱或恒温水浴中保温30min，然后在540nm波长下比色。

以亚硝态氮（μg）为横坐标，光密度值为纵坐标绘标准曲线或建立回归方程。

表13-1各试剂加入顺序

2.酶反应和酶活性测定

（1）取样：将材料（小麦、玉米等作物叶片）洗净，用蒸馏水冲洗，滤纸吸干。在叶

2

片中部打取直径1cm的圆片（或剪成0.5~1.0cm的小块），混匀后每个样品称0.3g3份，

放入试管并编号。

（2）反应：向各试管加入KNO异丙·醇磷酸缓·冲液混合液9ml，其中一管立即加1.0

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ml三氯乙酸混匀作对照。然后将所有试管置真空干燥器中接真空泵抽气，反复几次直至叶

片沉在管底。将各试管置30℃下于黑暗处保温30min，分别向处理管加1.0ml三氯乙酸，摇

匀终止酶活性。

（3）比色：将各试管静置2min，吸取上清液2ml加入另一组试管，以对照管做参比，

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按标准曲线做法进行显色测定，并计算酶活性（Nμg·gh·）。

式中C：反应液催化产生的亚硝态氮总量（μg）；

V1：反应液总体积（ml）；

V2：反应时加入的提取液体积（ml）；

W：样品重量（g）；

t：反应时间（h）。