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应用生物反应器培养ST细胞制备猪传染性

胃肠炎病毒

作者：何锡忠李春华潘洁张婉华彭丽英倪建平张春玲蒋凤英徐伟林

来源：《国外畜牧学猪与禽》·2014年第06期

摘要：通过生物反应器制备猪传染性胃肠炎病毒（TGEV），研究了感染复数（MOI）、

微载体浓度、病毒感染时间（TOI）和病毒维持液对病毒效价的影响，结果表明，分别以1：

500稀释种毒（8.0LgTCID50/mL）后接种、接种72h的ST细胞、5mg/mL微载体浓度和维持

液低糖DMEM+0.2%水解乳蛋白（LH）的参数培养方式效果最为理想。

关键词：猪传染性胃肠炎病毒；参数；ST细胞；生物反应器

中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1001-0769（2014）06-0048-03

猪传染性胃肠炎病毒（TransmissibleGastroenteritisVirus，TGEV）是猪的一种高度接触传

染性肠道疾病，以引起2周龄以下仔猪呕吐、严重腹泻和高死亡率（通常100%）为特征[1]。

目前，国内一般采用克氏瓶或转瓶培养ST细胞生产猪传染性胃肠炎（TGE）疫苗，存在劳动

强度大、病毒毒价低和疫苗质量不稳定等缺点。应用生物反应器系统和微载体培养贴壁细胞具

有高比表面积、细胞产量高，便于监测、控制和取样，生产规模容易放大，不易染菌等优点。

生物反应器培养细胞繁殖狂犬病病毒，病毒最大滴度能达到1.38×108pfu/mL[2，3]，应用激流

式生物反应器可以实现HP-PRRSV抗原的高滴度生产[4]，且生产的疫苗质量达到WHO要

求。为此，本文对生物反应器系统和微载体培养ST细胞制备猪传染性胃肠炎病毒进行研究，

以探讨利用生物反应器培养ST细胞生产猪传染性胃肠炎病毒的技术可行性，为进一步优化培

养过程和大规模工业化生产疫苗提供依据。

材料1与方法

材料1.1

1.1.1细胞和培养基

猪睾丸（ST）细胞由上海市农业科学院畜牧兽医研究所研发中心提供；培养基为含100

mL/L新生牛血清（Hyclone公司）的DMEM（GIBCO公司）；病毒繁殖培养基为含2g/L水

解乳蛋白（LH）的低糖DMEM（LG-DMEM）、MEM和高糖DMEM（HG-DMEM）。

1.1.2病毒

TGEV由上海市农业科学院畜牧兽医研究所研发中心分离、鉴定和保存。

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1.1.3微载体（CytodexTM3）

购自AmershampharmaciaBiotchAB公司；CT-3微载体，经无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲

液浸泡，121℃高压灭菌30min，再浸泡在含100mL/L新生牛血清的DMEM的培养基中，置

37℃、50mL/LCO2培养箱过夜，待用。

1.1.4生物反应器

1.5LCelliGen生物反应器（NewBrunswickScientificCo.LTDUSA公司），工作体积1.2

L，溶氧（DO）和pH由压缩Air、O2、N2和CO24种气体控制，笼式搅拌桨由磁力驱动器驱

动。

方法1.2

1.2.1细胞培养

适量T-50方瓶ST细胞，长满单层时，先用含0.2g/LEDTA的PBS液清洗3次，再加入

含2.5g/L胰酶消化片刻，倾去胰酶，加含100mL/L新生牛血清的DMEM培养基，吹打备

用。安装好反应器和管路后，分别用pH值为4.00和6.86的标准pH溶液在25℃下标定pH电

极。在罐内加入PBS液，121℃高压灭菌。冷却后安装到反应器控制系统上，连接好压缩

Air、O2、N2和CO24种气体管线，校正DO电极后，将罐内PBS液压