从动物肝组织中分离提取酶课件.ppt

从动物肝组织中分离提取酶;设计从动物肝组织中分离、提取、纯化、和鉴定一种酶（该酶由不同的亚基组成，为结合酶，pI=6.2）的技术路线，并说明试验各步骤的原理;样品上样、乙酸铵溶液洗脱收集，以20%三氯乙酸或磺基水杨酸溶液检测蛋白质含量为纵坐标，收集管号为横坐标，绘制洗脱峰曲线，收集第一个峰的蛋白溶液

引发剂过硫酸铵（Ap），催化剂四甲基乙二胺（TEMED）

SDS(十二烷基磺酸钠）能打断蛋白质的氢键和疏水键，按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。

离子交换柱层析法分离纯化肝酶

25%考马斯亮蓝R250漂洗（10-20min）脱色）

DEAE-纤维素为阴离子交换剂，在pH6.

SDS-聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离纯度

离子交换柱层析法分离纯化肝酶

沉降系数是为颗粒在离心力场的作用下，从静止状态到达极限速度所需要的时间。

动物肝脏酶的初步分离提取

防止蛋白酶的水解作用：

离心，去上清，留沉淀

得出一条带则说明分离的蛋白质纯度较高

装柱与平衡（乙酸铵溶液）

离子交换层析是利用离子交换剂对各种离子有不同的亲和力，来分离各种离子的层析技术。

离子交换柱层析法分离纯化肝酶

待测蛋白质样品的制备（加入4*缓冲液）

配制高浓度的硫酸铵溶液，测溶液PH值并用稀硫酸或氨水调PH到6.

样品上样、用乙酸铵缓冲液洗脱收集，以蛋白质含量为纵坐标，收集管号为横坐标，绘制洗脱峰曲线，收集第二个峰的酶溶液即为PI=6.

离子交换柱层析法分离纯化肝酶

动物肝酶的初步分离提取

设计从动物肝组织中分离、提取、纯化、和鉴定一种酶（该酶由不同的亚基组成，为结合酶，pI=6.

加缓冲溶液溶解，将溶液放入透析袋中透析，得含酶的溶液

SDS-聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离纯度

垂直板状聚丙烯酰胺凝胶的灌制

结合酶：分蛋白质部分：酶蛋白(apoenzyme)和辅助因子(cofactor)，辅助因子中含金属离子、小分子化合物

样品上样、用乙酸铵缓冲液洗脱收集，以蛋白质含量为纵坐标，收集管号为横坐标，绘制洗脱峰曲线，收集第二个峰的酶溶液即为PI=6.

SDS-聚丙烯??胶电泳鉴定肝酶分离纯度

配制高浓度的硫酸铵溶液，测溶液PH值并用稀硫酸或氨水调PH到6.

（但沉淀不同的蛋白质所需盐类的浓度不同。;实验流程：;1.取动物肝组织;*;梯度离心获得含有酶的细胞液;离心管中加入5ml0.34M蔗糖，将5ml匀浆轻轻覆在其上，1600r/min离心10min，得上清液（1）

沉淀加10ml0.25M蔗糖混匀，3500r/min离心10min，得上清液（2）

将上清液（1）（2）混合取1ml,6600r/min离心10min，得上清液，即为酶体和微粒体;实验流程：;3.动物肝脏酶的初步分离提取;配制高浓度的硫酸铵溶液，测溶液PH值并用稀硫酸或氨水调PH到6.2

将酶溶液与硫酸铵溶液混合，静止一段时间

离心，去上清，留沉淀

加缓冲溶液溶解，将溶液放入透析袋中透析，得含酶的溶液;实验流程：;4.离子交换柱层析法分离纯化肝脏酶;4.离子交换柱层析法分离纯化肝脏酶;DEAE-纤维素处理为PH值为6.1（Hcl）

装柱与平衡（乙酸铵溶液）

样品上样、乙酸铵溶液洗脱收集，以20%三氯乙酸或磺基水杨酸溶液检测蛋白质含量为纵坐标，收集管号为横坐标，绘制洗脱峰曲线，收集第一个峰的蛋白溶液

处理DEAE-纤维素溶液为PH=6.3

装柱与平衡（乙酸铵溶液）

样品上样、用乙酸铵缓冲液洗脱收集，以蛋白质含量为纵坐标，收集管号为横坐标，绘制洗脱峰曲线，收集第二个峰的酶溶液即为PI=6.2左右的蛋白质溶液;实验流程：;5.肝酶活性检验;若结合酶含有辅基，则直接加入底物，根据生成物的性质进行生成物的鉴定

若结合酶含有辅酶，则加入辅助因子（小分子有机化合物和金属离子）然后再加入底物鉴定SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定酶的分离纯度;实验流程：;6.SDS-聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离纯度;不连续凝胶电泳的支持体由分离胶和浓缩胶组成。上层为浓缩胶，下层为分离胶，两层中Acr（丙烯酰胺）浓度不同，孔径大小就不同，带电荷蛋白质离子在浓缩胶中泳动时，因受阻力小，泳动速度较快。当泳动到小孔径分离胶时，遇到阻力大，移动速度逐渐减慢，使样品浓缩成很窄的区带。;待测蛋白质样品的制备（加入4*缓冲液）

垂直板状聚丙烯酰胺凝胶的灌制

加样（酶溶液）

电泳（浓缩胶80V分离胶150V）

剥胶

染色和褪色（0.25%考马斯亮蓝R250漂洗（10-20min）脱色）

得出一条带则说明分离的蛋白质纯度较高