原创力文档- 1、本文档共6页，可阅读全部内容。
- 2、原创力文档（book118）网站文档一经付费（服务费），不意味着购买了该文档的版权，仅供个人/单位学习、研究之用，不得用于商业用途，未经授权，严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等，侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传，本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺！文档内容仅供研究参考，付费前请自行鉴别。如您付费，意味着您自己接受本站规则且自行承担风险，本站不退款、不进行额外附加服务；查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档，您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等，请点击“版权申诉”（推荐），也可以打举报电话：400-050-0827(电话支持时间：9:00-18:30)。
- 5、该文档为VIP文档，如果想要下载，成为VIP会员后，下载免费。
- 6、成为VIP后，下载本文档将扣除1次下载权益。下载后，不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 7、成为VIP后，您将拥有八大权益，权益包括：VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 8、VIP文档为合作方或网友上传，每下载1次， 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等，对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
第四节：凝胶蛋白质点的酶解
一.蛋白质点酶解
准备工作：
1.检查冻干机，调好水浴锅（37C,56C）
2.检查各种试剂的量是否足够（DTTIAANHHCO）
43
3.检查酶解房卫生状况
每一步注意事项：
1.每一步加入的液体量视胶块大小定，一般是50uL/管
2.每次震荡后随手甩一下，以便把胶块和管壁上的液滴甩下来
3.每次打开EP管盖子前，确认胶块在管内，并将胶块甩至管底。开盖子动作尽量轻巧，
以免胶块弹出。
4.在冻干样品后，要确保样品在管底，以防样品与封口膜一起被去掉。
酶解前配制
1）、100mmol/L的NHHCO
43
参考配制10mL称79.06mgNHHCO溶于10mL水中
43
以后每一步25mmol/L的NHHCO可用100mmol/L的NHHCO稀释。
4343
2）、1mol/L的DTT
参考配制10ML称1.55gDTT溶于10mL水中，1mL分装，避光贮存（锡
箔包），-20度永久保存
酶解步骤：调水浴锅到37C以便做脱色用，此外，调水浴锅到57C,以便做还原用。
1•冲洗胶块：用水洗衣胶块2次，
2.脱色：用含有25mmol/L的NHHCO的50%的乙腈37C保温30min。如第一次脱
43
色不完全可再脱一次
3.干燥：吸出液体后，先加50%^腈，再加100%勺乙腈。
4.还原：加入还原剂，圭寸口，57T水浴一小时，还原蛋白质
还原剂：25mmol/L的NHHCO（含10mmol/LDTT）
43
参考配制方法（4mL）:6.2mgDTT溶于4mL25mmol/L的NHHCO中
43
注意事项：1.注意在水浴锅上写纸条标明使用者名字，水温和使用的时间段，方便实验之间的协调和
发生停电等意外情况时别的同学帮助临时处理样品。
2•水浴锅用完后恢复到还原前的初始状态，以免后来的同学做实验时因为习惯或者经验忽略此处造
成不必要的失误。
5.烷基化将样品从水浴锅中取出后，室温冷却，去掉液体，迅速加入同样体积的烷基
化试剂室温暗处放置45min,使之碘乙酰胺化。
烷基化试剂：25mmol/L的NHHCO（含55mmol/LIAA）
43
参考配制方法（4mL）:40.69mgIAA溶于4mL25mmol/L的NHHCO中
43
注意事项：1、样品多的时候，可以将先加了烷基化试剂的样品先放入暗处，并记住放入顺序和时
间，以便取出时按时间顺序处理。
2、注意实验时暗处的卫生情况，应该放在干净处，且建议在取出后先用酒精把样品盒擦拭后再做后
续实验。
6.反应完成后去掉液体，依次用25mmol/L的NHHCO溶液50%勺乙腈，100%勺乙
43
文档评论（0）