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鸡伤寒沙门氏菌快速检测技术

1范围

本标准规定了鸡伤寒沙门氏菌鉴别培养基和CPA检测技术

本标准适用于各种禽类携带鸡沙门氏菌的检疫、诊断、监测和流行病学，也可用于规模化种鸡场中伤寒沙门氏菌的净化。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

NY/2838-2015沙门氏菌病诊断技术

GB/4789.4-2016食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T13091-2018饲料中沙门氏菌的测定

GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

NY/541-2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4培养基和主要试剂

4.1BPW前增菌液（见附录A.1）。

4.2SC增菌液（见附录A.2）。

4.3TTB增菌液（见附录A.3）。

4.4沙门氏菌显色培养基（见附录A.4）。

4.5革兰氏染色液（见附录A.5）。

4.6细菌生化鉴定试剂盒。

4.7细菌基因组DNA提取试剂盒。

4.82XSGFastqPCR预混液。

5主要仪器设备和玻璃器皿

恒温培养箱：37℃±1℃。电热恒温水槽。

5.3普通冰箱。

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5.4天平：感量为0.1g、0.01g、0.0001g。

5.5振荡器或漩涡混合器。

5.6显微镜：1000倍。

5.7pH计：精确度0.1。

5.8无菌玻璃或塑料培养皿Φ=90mm、无菌锥型瓶、无菌玻璃或塑料涂布棒。

5.9量筒：250mL。

5.10微量移液器（最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL）。

5.1120000g低温高速离心机。

5.12实时荧光PCR仪。

6样品采集、储存及运输

按照NY/T2838-2015中描述，选择具有典型临床症状的病死鸡，无菌取其病死或带菌禽的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及其他病变组织，标记名称和日期，冷藏运送到试验室进行检验。按照NY/T541-2016中6.2执行。

6.1肠内容物样品按照NY/T541-2016中执行，粪便样品按照NY/T541-2016中6.8.1执行，泄殖腔拭子按照NY/T541-2016中6.8.1执行。

6.2样品采集和样品处理应做好防护措施，避免交叉污染。

7沙门氏菌的分离鉴别

本标准前增菌、增菌方法按照GB4789.4-2016中5.1和5.2执行。

7.1鉴别培养

7.1.1取组织器官（均桨）、粪便、肛拭子等样品，按1:10的体积接种缓冲蛋白胨水，37℃培养24h，之后再按1:10的体积转增菌培养液，培养24h。

7.1.2分别用接种环取增菌液1环，划线接种于沙门氏菌属显色培养基平板。于36℃±1℃分别培养18h～24h。

7.1.3自显色培养基平板上挑取典型单菌落，做革兰氏染色（A.5）镜检。

7.2生化鉴定

按照GB4789.4-2010中5.4的规定执行。

区别鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的生化特征见表1。

表1鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的生化试验特征

试验

鸡白痢沙门氏菌

鸡伤寒沙门氏菌

三糖铁葡萄糖(产酸)

+

+

三糖铁葡萄糖（产气）

V

三糖铁乳糖

三糖铁蔗糖

三糖铁硫化氢

V

V

葡萄糖产气

+

-

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表1鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的生化试验特征（续）

试验

鸡白痢沙门氏菌

鸡伤寒沙门氏菌

尿素酶

氯化钾

氯化钾对照

+

+

赖氨酸

+

+

赖氨酸对照

+

+

甘露醇

+

+

山梨醇

+

+

水杨苷

-

-

丙二酸盐

-

-

运动性

-

-

ONPG

鸟氨酸脱羧作用

+

麦芽糖发酵

-或后+

+

卫矛醇

+

注:+,在1d~2d有90%以上为阳性;-,90%以上没有反应;V有不同的反应。

7.3探针法实时荧光定量PCR验证

7.3.1DNA的提取

用商用细菌基因组DNA提取试剂盒或常用提取方法（附录B）提取试样DNA，并设置阴性、阳性对照。

7.3.2引物

引物和Taqman探针序列见表2。

表2引物和探针信息表

菌株名称

引物和探针序列（5-3）

扩增长度/bp

鸡伤寒沙门氏菌

F:CA